——收集F生理盐水lmin。
[0077]将微囊化后的细胞置于37°C、5%⑶2培养箱中，DMEM完全培养基(购自Gibco BRL公司)常规培养，按时换液。7天后，用倒置显微镜观察形态。微囊化后细胞实现三维生长，增殖迅速。如图3所示，A为培养第7天微10x光镜图，B为培养第7天200x光镜局部放大图片，白色箭头所示为三维化生长的ifepG2细胞球。
[0078]实施例3:微囊成分改良前后微囊机械强度检测
[0079]本实施例以微囊破损率(破损微囊数与微囊总数之比)为指标考察微囊的机械强度。
[0080]将HepG2细胞分别与1.8 %海藻酸钠溶液(改良前组)、1.8 %海藻酸钠混合溶液(改良后组)充分混匀，按照实施例2分别制成微囊。将微囊悬于DMEM完全培养基中，调整培养基中的微囊数量为100个/ml。分别取新鲜制备的上述悬液50ml置于10ml烧杯中，在磁力搅拌机上分别以低、中、高速搅拌lmin，然后在显微镜下随机计数100个微囊中破损微囊个数，重复3遍。分别以低、中、高速组统计改良前组与改良后组的微囊破损率，统计检验选择Student-t检验，P〈0.05为差异有统计学意义，结果显示无论在低速组、中速组、高速组中，改良前组与改良后组的结果均无明显统计学意义，见图4。表明改良前后微囊机械强度无明显改变。
[0081 ]实施例4:微囊制备过程中磁响应性实验
[0082]本实施例以在外加磁场条件下，油水分离器中微囊完全沉降时间为指标考察微囊磁响应性。
[0083]将HepG2细胞分别与1.8%海藻酸钠溶液(准备2管，标记为A、B )、1.8 %海藻酸钠混合溶液(准备2管，标记为C、D)充分混匀，4管溶液分别按照实施例2步骤制备微囊到分离器时停止操作。A、C为一组，在油水分离器底部无外加磁场;B、D为一组，在油水分离器底部添加一大小相等，方向相同的磁场，大小为0.6T，观察记录两种情况下A、B、C、D微囊沉降速度，记录微囊完全沉降时间，重复3遍。统计各组沉降时间，统计检验选择单因素方差分析，组间比较选用LSD-t检验，P〈0.05为差异有统计学意义，结果显示A与B之间无明显统计学意义，C较A沉降时间缩短(P〈0.001)，D较C沉降时间缩短(P〈0.01)，见图5。
[0084]实验结果表明1.8%海藻酸钠混合微囊较单纯的1.8%海藻酸钠更易于油水分离，在外加磁场条件下，可进一步缩短混合微囊的沉降时间，表现出良好的磁响应性。
[0085]实施例5:微囊化原代肝细胞在肝衰竭类似血浆中耐受实验结果图
[0086]本实施例以原代肝细胞为种子细胞，使其微囊化后在肝衰竭类似血浆中与平面培养的原代肝细胞进行比较，用相应试剂盒检测细胞上清液中相应物质分泌量和肝细胞对肝衰竭类似血浆中有害物质的代谢情况。
[0087]取6-8周龄，体重25土2g，C57小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，按照文献所述胶原酶两步灌流法(潘君风.C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建[D].西北农林科技大学，2011)分离得到小鼠原代肝细胞。对照组(即平面培养组)为上述原代肝细胞IxlO6个使用常规方法培养，实验组(即微囊培养组)为等量上述原代肝细胞与1.8%海藻酸钠混合溶液充分混匀，微囊化后进行三维培养。两组细胞均置于37V,5%⑶2培养箱中，细胞培养6孔板，2ml/孔肝细胞Lonza培养基(购自Lonza公司)培养。培养I天后，将两组培养基均换成肝衰竭类似血浆，2ml/孔，进行耐受实验，具体步骤参照文献(薛琨，高森，潘明新，高毅.模拟构建人肝衰竭血清对体外培养肝细胞功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2010,51:9601-9604)。分别于24h、72h取两组培养上清，用丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、门冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、总胆红素(T-Bil)试剂盒、直接胆红素(D-Bil)、尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法)(试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)并按照试剂盒说明书所列方法检测上清中ALT、AST、TBIL水平，UREA分泌量。重复上述实验3遍，统计检验选择Student-t检验，P〈0.05为差异有统计学意义。
[0088]实验结果显示，24h时，平面培养组和微囊培养组两组的ALT(A)、AST(B)、UREA(C)结果无明显统计学差异，但到了 72h，微囊培养组ALT、AST (P〈0.05)较平面培养组有下降，1]1^4(?〈0.001)较平面培养组有升高。而，微囊培养组的1811^0)水平无论在2411(?〈0.01)还是72h(P〈0.05)均低于平面培养组，见图6。
[0089]实验结果表明，原代肝细胞在微囊化后，可以增强其抵抗肝衰竭类似血浆中有害物质的能力，显著降低ALT、AST水平，微囊化培养保护了肝细胞。微囊化培养可以保持原代肝细胞功能，合成能力(UREA分泌)和代谢能力(TBIL清除)均可长时间维持在一定水平。综上所述，原代肝细胞在微囊化后可更好的用于生物人工肝，清除肝衰竭病人血浆中的有害物质。
[0090]以上已对本实用新型创造的较佳实施例进行了具体说明，但本实用新型创造并不限于所述的实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型创造精神的前提下还可以作出种种的等同的变型或替换，这些等同变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1.一种微流体微囊发生装置，其特征在于，该发生装置包括上样推进组件、成囊组件、分离成膜组件； 所述的上样推进组件，包括微量推注栗和三个注射器； 所述的成囊组件，为连续的微流体通道;前端为微流体通道接入端，内置一个连续相通道和两个分散相通道;后端为中空的波形微流体通道； 所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器和旋转成膜台；所述的旋转成膜台由转台和至少六个收集管组成。2.根据权利要求1所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的微流体通道，采用微加工技术建立微流体通道网络;或者采用针头、聚合物管、中空纤维粘合而成。3.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的一个连续相通道和两个分散相通道分别与三个注射器相连。4.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的波形微流体通道最后伸入油水分离器中。5.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的发生装置还包括移液管。6.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的发生装置还包括网兜。7.根据权利要求1或2所述的一种微流体微囊发生装置，其特征在于，所述的油水分离器底部设置一个磁场发生装置。
【专利摘要】本实用新型涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种微流体微囊发生装置。本实用新型利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体对分散相液体的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊。本实用新型制备得到的人工肝细胞微囊，能较长时间的维持囊内种子细胞功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞治疗。
【IPC分类】A61L27/38, A61P1/16, A61J3/00, A61K35/407, A61L27/50, A61K41/00, A61K9/50
【公开号】CN205252065
【申请号】CN201521072130
【发明人】吴红平, 金晓芳, 唐为忠
【申请人】上海赛立维生物科技有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月21日