基于壳聚糖包裹ALV-J P-miRNA-env重组质粒纳米复合物及其制备方法和应用
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药和病毒学领域，具体涉及了一种基于壳聚糖包裹的ALV-JP-miRNA-env重组质粒纳米复合物及其制备方法和应用。
(二)
【背景技术】
[0002]J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一种肿瘤性疾病，其主要禽临床表现为髓细胞性白血病，并多以免疫耐受、高死亡率、生长迟缓和多组织器官出现肿瘤等为主要特征，我国ALV-J的发生成上升趋势，临床病例已经从商品肉鸡群发展到了商品蛋鸡、地方种鸡群及其他家禽，其发生特点主要含有发病早、感染率及发病率高、宿主广泛、致病性强、肿瘤多样化等。此外，以ALV-J为主的禽肿瘤性疾病还可与马立克氏病、网状内皮增生症等肿瘤性疾病混合感染，这大大增加疾病的预防和治疗难度，给养禽业带来巨大的经济损失。
[0003]由于ALV-J病毒囊膜蛋白的超变性及其自身的免疫逃避能力，至今对ALV-J的防治研究还未见显著成效，并且尚无有效控制和防治的药物或疫苗，也没有确实可行的防控措施。国外是通过净化来控制本病的发生，但由于其周期长、成本高等原因，国内目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡进行大群净化。此外，不合理、不科学的净化措施，还会加速病毒的进化和突变，使疾病愈加复杂，基于我国的养殖现状，寻求ALV-J防控的新技术、新手段有着重要的现实意义。
[0004]近年来，随着分子生物学技术及基因工程药物的不断发展，对基因药物及其递送系统的研究成为当前研究的热点，壳聚糖是自然界中唯一的碱性多糖，不溶于水，可溶于醋酸和无机酸等稀酸溶液。其化学名称为聚葡萄糖胺，是由线性聚合物甲壳质经脱乙酞反应后的产物。甲壳素是一种天然高分子化合物，自然界中，甲壳质广泛存在于低等生物菌类，藻类的细胞，节支动物虾、蟹、昆虫的外壳，软体动物(如鱿鱼、鸟贼)的内壳和软骨，高等植物的细胞壁等，甲壳素每年生命合成资源可达2000亿吨，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源，是人类取之不竭的生物资源。甲壳素结构式中糖基上的N-乙酞基大部分被去掉的话，就是甲壳素的最为重要的衍生物一壳聚糖，脱乙酰度是用来表征壳聚糖大分子链中伯氨基含量的，脱乙酰度大于85%的壳聚糖称为高脱乙酰度壳聚糖，含有大量的伯氨基。伯氨基在偏酸性条件带正电荷，能够很好地吸附DNA或RNA，而且伯氨基具有结合氢离子的能力，因此壳聚糖具有一定的缓冲能力，能够帮助壳聚糖逃离内小体。它来源广泛，具有良好生物相容性和生物降解性，对人体无毒无害;现有技术中壳聚糖作为作为载体承载对应的小RNA或其他靶向药物的技术方案在人药的肿瘤药物、核酸药物领域均有涉及，但是在禽类白血病方面一直都是空白，如何利用壳聚糖获得抗禽白血病生物制剂成为亟待解决的问题之一。
(三)
【发明内容】
[0005]针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种小干扰基因药物的制备技术及应用，更为具体的涉及基于天然阳离子载体壳聚糖与J-亚群禽白血病ALV-JP-miRNA-env基因形纳米复合物及其制备方法和应用，结果显示采用本发明制备的CTS-P-miRNA-env纳米复合物可比原裸质粒的抑制ALV-J病毒复制的效果更明显，能更为有效地防治J亚群禽白血病发生和传播，为禽白血病防控提供了新的抗病毒方法和手段，也为其成抗禽白血病生物制剂的临床应用提供了技术支持。
[0006]本发明是基于下述理论基础进行的深入研究获得的:
[0007]小干扰基因药物是目前国际上最先进的一种生物医药技术，无论是国内还是国际，在建立多靶向药物设计加强小干扰核酸药物疗效和改善体内药物导入效率的创新技术上发展可谓是日新月异。
[0008]RNA干扰(RNAi)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种生物学现象。利用RNA干扰技术能特异性抑制致病基因的表达，具有高效和多样化的特征，在包括肿瘤在内的畜禽疾病治疗中极具潜力。
[0009]在RNAi药物开发中，一方面，需要不断发现新的靶点并弄清其功能和作用机制，从而指导临床开发切实有效的RNA药物用于重大疾病诊断和治疗中，为养殖者带来真正福音。另一方面，由于siRNA稳定性差，易于降解，细胞摄入差，转运入胞质效率低以及缺乏靶向能力，因此小干扰基因药物开发的另一个重要关键是开发高效的递送系统。
[0010]壳聚糖表面带有正电荷，使其能通过静电吸附作用携带带负电荷的重组质粒基因，从而通过空间位阻效应，防止体内核酸酶对质粒DNA的降解;壳聚糖为水溶性高分子，可解决基因载体制备和转染过程中的沉淀问题;壳聚糖为多糖类物质，可与某些肿瘤表面的多糖受体结合，增加该类基因载体的肿瘤靶向性;壳聚糖是可生物降解的高分子材料，可通过纳米生物技术达到基因的控制缓慢释放，从而使基因治疗达到最佳效果。因此本发明基于筛选获得的能显著抑制ALV-J的囊膜蛋白结构基因(env)，以表达获得小干扰RNA重组表达质粒为靶向药物，选择壳聚糖纳米粒为ALV-J临床制剂的药物载体，制备抗ALV-J重组表达干扰质粒-壳聚糖纳米复合物临床制剂。
[0011]本发明的具体实现步骤如下:
[0012]对P-miRNA-env重组质粒进行去内毒素大量提取，并测序鉴定，对壳聚糖、P-miRNA-env纳米复合物的制备条件进行摸索;对制备的壳聚糖、P-miRNA-env纳米复合物进行粒径、形态、包封率、抗DNAseI消化能力等进行检测;细胞转染检测壳聚糖、P-miRNA-env纳米复合物体外抑制ALV-J病毒复制效果并探索其有效剂量，
[0013]其中CTS-P-miRNA-env纳米复合物的制备方法如下:
[0014]采用复凝聚法制备CTS-P-miR-env纳米复合物:将60yg无RNase的P-miR-env(0.225ug/yL)加入到lmg/ml TPP水溶液ImL中，混合均匀；将P-miR-env-TPP溶液用2ml针头点滴状滴入3mL浓度为2mg/ml的壳聚糖醋酸溶液中，滴加速度为40d-50d/min，滴入后漩涡混合30s，室温孵育30min ；收集纳米复合物混悬液于无RNAse、无DNase的EP管中即得；
[0015]通过控制上述制备工艺，本发明最终得到的纳米复合物粒径范围在100纳米左右(90-110纳米)，现有技术中还没有获得过这一粒径范围的产品，而这个范围的粒径进入动物体内更加容易，转染效率更好，较之人体使用范围也有不同；
[0016]除此之外本发明还包括P-miRNA-env重组质粒的转化和提取以及壳聚糖空白纳米粒的制备。
[0017]本发明获得的纳米复合物各项性能检测得到指标如下:
[0018](I)透射电镜观察:纳米复合物形态均匀，呈球形或类球形，大小在10nm左右；(2)粒径测量仪分析测定纳米复合物粒径，98%的纳米复合物粒径为103纳米，分散度良好；(3)纳米复合物包封率的测定计算包封率的平均值为88%。各项指标均说明得到的纳米复合物性能良好，结构稳定，为下一步细胞转染奠定基础。
[0019]为了进一步验证该纳米复合物的性能，发明人进行了DF-1细胞转染:选择细胞转染常用试剂脂质体作为对照，同时设置不做任何处理的细胞作为空白对照，将CTS-P-miR-env纳米复合物分低、中、高3个剂量对细胞进行转染，于24、48、96h分别用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染率和转染效率;用MTT检测细胞毒性，Real-time PCR检测各组细胞中ALV-J mRNA的表达;Western blot检测病毒囊膜蛋白表达水平。
[0020]结果显示，CTS-P-miR-env纳米复合物低、中剂量组和高剂量组转染率均高于脂质体对照组，而细胞毒性低于脂质体对照组。Real-time PCR检测CTS-P-miR-env纳米复合物对ALV-J的增殖比裸质粒起到了更好的抑制效果，Western blot检测ALV-J囊膜蛋白的表达量较ALV-J脂质体对照组和裸质粒组来说有明显的降低，说明制备得到的CTS-P-miR-env纳米复合物在抑制ALV-J的复制与表达方面较裸质粒和脂质体为转染剂的质粒组作用效果更佳。
[0021 ]综上所述，与现有技术相比本发明确定了基于壳聚糖包裹的P-miR-env形成纳米复合物制备抗ALV-J临床制剂小干扰基因药物的方法，CTS-P-miR-env纳米复合物可有效抑制J亚群禽白血病病毒的复制，为抗病毒生物制剂及临床应用提供了基础，同时提供了优化后的壳聚糖、P-miR-env重组质粒的制备条件，更进一步确定了 CTS-P-miR-env纳米复合物抑制病毒复制的有效剂量，进而提供了一种可有效控制J亚群禽白血病病毒感染的方法，解决了养禽业J亚群禽白血病病毒感染有效控制的难题，与传统方法相比较，能大幅度的降低J亚群禽白血病造成的直接和间接经济损失，开创了禽肿瘤性病毒防治研究的新思路。
(四)
【附图说明】
[0022]图1为CTS-P-miR-env纳米复合物粒径测量图，
[0023]由图可知，本发明获得纳米复合物形态均匀，呈球形或类球形，大小在10nm左右，其中98%的纳米复合物粒径为103纳米左右；
[0024]图2为CTS-P-miR-env纳米复合物抗DnaseI消化电泳图，
[0025]图中M为D