一种用于治疗乳腺癌的基因工程疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及基因工程疫苗，具体涉及一种用于治疗乳腺癌的 基因工程疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中 就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的 增长速度却高出高发国家1~2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年 公布的2009年乳腺癌发病数据显示:全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的 第1位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为 23.12/10 万。
[0003] 目前，肿瘤疫苗主要有如下类型。
[0004] 肿瘤细胞疫苗。传统的瘤苗是通过自体或同种异体肿瘤细胞或其粗提物，经过物 理、化学或生物方法处理后，抑制其生长能力，保持并增强其免疫原性。但这种疫苗的免疫 原性弱，难以引起免疫应答。后来，将肿瘤细胞加入佐剂如卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌或弗 氏佐剂等以增强其免疫原性，但效果仍不理想。而且这种疫苗制备耗时较长，不能满足快速 免疫的需要。近年来对全细胞瘤苗进行了改进，已尝试用建株的的肿瘤细胞系作为其替代 物。动物实验证实，使用处理过的建株肿瘤细胞作为全细胞瘤苗具有以下优点：（ a)肿瘤细 胞表达多种抗原，避免了分离、鉴定抗原的烦琐；（b)用作疫苗的肿瘤细胞表达的MHC可以与 患者不匹配，可作为同种异体抗原，激发免疫应答；（c)用建株肿瘤细胞制备疫苗，简单易 行，大大缩短了患者从确诊到接种疫苗的时间。
[0005] 肿瘤基因工程疫苗。肿瘤基因工程疫苗是一种通过基因重组技术将目的基因导入 受体细胞而制备的疫苗。随着免疫基础理论的发展，各种疫苗的研制也日新月异。国内外学 者己将不同的目的基因导入受体细胞，提高其免疫原性或活化效应细胞的能力。这种疫苗 主要从以下几个方面来实现其抗瘤效应：（a)提高机体抗瘤能力；（b)增强肿瘤免疫原性； (c)基因产物直接杀伤瘤细胞。近几年有关肿瘤基因工程疫苗研究的热点主要集中在GM-CSF基因疫苗、多基因联合修饰疫苗、基因修饰树突状细胞和构建树突状细胞疫苗，以及免 疫修饰基因与自杀基因的联合。如将B7-1和IL-4，B7-1和IL-7，IFN-Y、GM-CSF和B7-l，IL-l2、B7-l和肿瘤抗原等多细胞因子基因进行联合修饰。多种细胞因子与自杀基因的联合转 染能扬长避短相互协同，具有更好的免疫效应。
[0006] 树突状细胞(DC)疫苗。目前用肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞RNA体外冲 击DC或将TAA基因转入DC内，均被认为是颇有前途的瘤苗制备方案。但各种体外冲击手段 均有半衰期短的缺点，若要诱导出高水平的持久的抗肿瘤免疫反应，需反复多次体内回输 致敏DC。另外一种用肿瘤cDNA或mRNA体外冲击DC的方法可以解决抗原丢失或抗原变异的问 题，而且又避免了分离大量肿瘤抗原肽的困难。现代分子生物学技术己可以较容易地大量 扩增肿瘤mRNA及构建肿瘤的cDNA文库，这为我们提供了庞大的肿瘤抗原库，也为应用cDNA、 mRNA体外冲击DC细胞提供了原料。体外用肿瘤cDNA或mRNA冲击DC细胞无须确定肿瘤抗原， 而且理论上讲冲击后的DC细胞可以表达任何一种可能的肿瘤相关抗原，因而被一些研究采 用并取得了良好的效果。
[0007] 肽疫苗。抗原提呈过程和免疫识别的研究，己证实肿瘤抗原须在APC胞内降解为短 肽，最后形成肽-MHC-TCR复合物才能为T细胞识别，并激发CTL反应，这为肽疫苗的研究提供 了理论依据。所用肿瘤抗原多肽可分为两类:人工合成多肽和自然源性多肽。合成多肽疫苗 是随着肿瘤抗原表位的确定发展起来的。根据肿瘤抗原表位合成相应的多肽，然后与佐剂 一起或单独免疫，可以诱导针对免疫原性表位的抗肿瘤免疫反应。合成多肽疫苗的优点在 于:诱导免疫反应的特异性较高;可以大量合成;抗原纯度高;对各种组织型应用广泛;仅需 要少量的病人肿瘤组织（用于确定抗原的表达）；可以激活CD+4T和CD+ST细胞。合成肽疫苗 的这些优点使之成为一种重要的的疫苗策略。
[0008] 核酸疫苗。核酸疫苗是由能引起保护性免疫反应的抗原基因片段及其载体构建而 成。包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。与其他疫苗相比，DNA疫苗具有许 多优点：接种基因可以长期表达，诱导的免疫反应持久高效；制备简单，容易构建，经济省 时；与重组蛋白相比，基因疫苗更接近于自然感染状态;免疫反应强烈，特异，广泛，全面，且 能够产生交叉免疫保护；核酸疫苗能同时激发机体细胞免疫和体液免疫反应，能诱导许多 亚单位疫苗所不能诱导的CTL效应;稳定性好，容易保存;可以诱导不成熟免疫系统产生T细 胞免疫应答;无感染复制危险，不会产生回复突变;可用同一载体制备针对多种疾病的基因 疫苗，研制多价疫苗。
[0009] GM-CSF(粒巨细胞集落刺激因子)是一种主要由巨噬细胞和活化细胞产生的细胞 因子，其可通过促进分化成熟树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞分化、成熟和活化进而 促进Th、Tc、NK识别肿瘤相关抗原，在肿瘤部位浸润，引起系统性抗肿瘤反应，杀伤肿瘤的同 时还可促进细胞CD45T细胞分化成熟及黏附分子B7/BB1的表达，提高其抗原呈递能力。另外 还可增加巨噬细胞主要组织相容性复合物II (MHCII)的表达，提高其抗原呈递能力。GM-CSF 基因修饰的肿瘤细胞被放射线灭活后往体内注射，可增加局部炎性反应，大量多核细胞、巨 噬细胞和DC浸润，促进肿瘤抗原呈递，能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种新型的乳腺癌基因工程疫苗，该基因工程疫苗包括 GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞和佐剂;其中，GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞可稳定表 达GM-CSF，杀伤肿瘤细胞;佐剂可以显著增强GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞对乳腺癌细 胞的杀伤力，二者具有显著的协同作用。
[0011] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0012 ] -种用于治疗乳腺癌的基因工程疫苗，包括GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞和佐 剂；
[0013] 所述GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞通过如下步骤制备：
[0014] 步骤S1，用含GM-CSF基因的重组仙台病毒上清液感染人乳腺癌细胞，得到GM-CSF 基因修饰的人乳腺癌细胞；
[0015] 步骤S2,对步骤S1得到的GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞灭活并进行热休克处 理；
[0016] 所述佐剂通过如下步骤制备：
[0017] 步骤S1，取对数生长期的人乳腺癌细胞接种于含体积百分比10%FBS的RPMI 1640 细胞培养液中，加入15~25ymol/mL的如下结构式的化合物（I)培养36~48h得细胞培养液，
[0019] 步骤S2,将细胞培养液离心弃上清液，沉淀悬浮于生理盐水中，再放入液氮中冷冻 5~10分钟，再将冷冻物取出，放入37°C温水融化，如此反复冻融3~5次，即可得所述佐剂。
[0020] 进一步地，所述佐剂通过如下步骤制备：步骤S1，取对数生长期的人乳腺癌细胞5 X 1〇7个接种于lml含体积百分比10%FBS的RPMI 1640细胞培养液中，加入20ymol/mL的所 述化合物（I)培养42h得细胞培养液;步骤S2，将细胞培养液离心弃上清液，沉淀悬浮于lml 生理盐水中，再放入液氮中冷冻5~10分钟，再将冷冻物取出，放入37°C温水融化，如此反复 冻融3~5次，即可得所述佐剂。
[0021] 进一步地，所述人乳腺癌细胞为SKBR3人乳腺癌细胞系。
[0022] 进一步地，所述灭活方法为采用6()C〇照射灭活。
[0023]进一步地，所述热休克处理方法为：将人乳腺癌细胞置于42°C~65°C条件下温浴 0.5h~2h。
[0024]所述的乳腺癌基因工程疫苗在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0025]本发明的优点：
[0026]本发明提供的基因工程疫苗包括GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞和佐剂;其中， GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞可稳定表达GM-CSF，杀伤肿瘤细胞;佐剂可以显著增强GM-CSF基因修饰的人乳腺癌细胞对乳腺癌细胞的杀伤力，二者具有显著的协同作用，能够协同 预防和治疗乳腺癌，特别是反复多次接种能够进一步提高预防或治疗肿瘤的效果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。未详 细描述的试验方法均为本领域常规试验操作，未特别强调的仪器和试剂均为本领域常规仪 器和试剂。
[0028] 实施例1 :GM_CSF基因修饰的人乳腺癌细胞的制备
[0029] 第一步:含信号肽的粒巨细胞集落刺激因子cDNA的制备
[0030] 1、粒巨细胞集落刺激因子mRNA的制备：
[0031] (1)人外周血淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，共约IX 1〇6细胞，经诱导刺激30 小时，使细胞因子基因表达，以备抽提mRN