腺嘌呤在制备调控hepcidin表达药物中的应用
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种腺嘌呤（A d e n i n e)的应用，特别涉及一种腺嘌呤在制备调控 hepcidin表达药物中的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 铁是人体必需微量元素之一，铁代谢平衡紊乱，会导致体内铁缺乏或铁过载。肝脏 分泌的铁调素 Η印cidin通过控制铁的吸收和再循环利用维持体内铁稳态的平衡。遗传缺陷 导致的低水平ifepcidin是原发性血色病发生发展的重要因素。
[0003] 血色病是一种常染色体隐形遗传病，90%的血色病是由于HFE基因上一个点突变 导致蛋白序列中第282位半胱氨酸被酪氨酸取代(C282Y)所致。其次常见突变为H63DAFE相 关遗传学血色病的特征为机体的铁过量摄取和进行性铁超载。临床症状与组织铁蓄积相 关。肝脏最常被累及，伴有脂肪肝与肝硬化，甚至诱发肝癌。其次是心血管系统，还可能发生 糖尿病、性功能障碍、关节病及皮肤色素沉积。因此，以铁调素 Hepcidin为靶点，靶向筛选 Η印cidin的激动剂对治疗遗传性血色病及因铁蓄积导致的相关疾病具有重要意义。
[0004] 另有一些基因与其他类型的铁过载症相关，如青少年血色病、TFR2相关的血色素 沉积症、Ferroportinl相关铁超载。
[0005] 腺嘌呤，早期的文献中将其归入维生素 B族。维生素 B族有十二种以上，目前被世界 一致公认的有八种，包括维生素 Bl(硫胺素）、维生素 B2(核黄素）、维生素 B3(烟酸）、维生素 B5(泛酸）、维生素 B6(吡哆醇）、维生素 B12(氰钴胺）、维生素 B9(叶酸）、维生素 B7(生物素）。 这些维生素全是水溶性维生素，在体内滞留的时间只有数小时，必须每天补充。B族是所有 人体组织必不可少的营养素，是食物释放能量的关键。因其全是辅酶，参与体内糖、蛋白质 和脂肪的代谢，因此被列为一个家族。
[0006] 腺嘌呤是组成DNA和RNA的重要成分。其在体内主要以腺嘌呤核苷酸的形式存在， 在体内代谢途径(metabolic pathways)中参与形成多种重要的中间物质，如ATP、NADP等。 其合成代谢包括从头合成途径和补救合成途径。从头合成途径主要在肝脏，以磷酸核糖、天 冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、一碳单位和C0 2为原料。值得注意的是：嘌呤核苷酸是在磷酸核 糖分子基础上逐步合成的，不是首先单独合成嘌呤碱然后再与磷酸核糖结合的。嘌呤核苷 酸的补救合成主要是体内某些组织器官如脑、骨髓等缺乏从头合成嘌呤核苷酸的酶系，从 而只能进行此途径，且该途径可以节省从头合成时能量和一些氨基酸的消耗。嘌呤核苷酸 在体内最终分解成尿酸，随尿排出体外，尿酸过多引起痛风症。
[0007] 医药应用方面，因其参与DNA和RNA的合成，能促进白细胞增生，使白细胞数目增 多，可用于肿瘤放射治疗、肿瘤化学治疗和苯中毒等引起的白细胞减少症。 (三)
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供腺嘌呤的药物新功能应用，提供一种腺嘌呤在制备上调 h印cidin表达药物中的应用，为治疗血色病的新药筛选提供基础。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种腺嘌呤在制备调控hepcidin表达药物中的应用，所述药物为激活 hepcidin表达的药物，具体所述调控hepcidin表达药物为治疗遗传性血色病、地中海贫血、 铁超载的酒精性肝炎、病毒性肝炎、脂肪肝或高铁诱发的肿瘤药物。
[0011]通常，所述药物由腺嘌呤和食品或药品上可接受的载体制成，所述腺嘌呤质量终 浓度为〇.〇5%-〇.2%，优选0.1%。所述药物剂型包括片剂、胶囊或颗粒剂。从易于制备和给 药的立场看，优选的药物是口服药物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。
[0012] 我们研究发现腺嘌呤能在体外通过上调Smadl/5/8信号通路和MEK/ERK信号通路 的磷酸化而显著激活人源肝癌细胞Huh7铁调素 Hepcidin的表达，呈现较强的时间、剂量依 赖性。通过荧光素酶报告基因手段，发现腺嘌呤对HAMP基因的转录展现出一致的激活效果。 进一步血色病模式动物体内试验证实，腺噪呤激活肝脏Hepcidin表达的同时，可以减少肝 脏铁。该研究结果为腺嘌呤改善ifepcidin降低导致铁代谢紊乱疾病提供了理论依据。
[0013] 本发明的有益效果主要体现在：目前治疗遗传性血色素沉着症的铁螯合剂毒性作 用大，而放血疗法一些病人不能耐受，肝移植风险高花费大，直接给予hepcidin治疗价格昂 贵，难以持久。腺嘌呤作为主要治疗白细胞减少症临床药物毒副作用小，价格合适，易于长 期使用。本发明所述腺嘌呤能够明显促进肝脏Hepcidin的分泌，降低血清铁和转铁蛋白饱 和度，显著降低肝脏铁水平，减缓小鼠血色病表型。开拓了腺嘌呤的新用途，为因 Hepcidin 调控素乱引起的铁代谢疾病及相关并发症治疗提供了可能，特别在相关疾病的临床药物开 发有着潜在的应用。 (四）【附图说明】
[0014] 图1为腺嘌呤体外激活Huh7细胞HAMP基因表达；
[0015] A: 0μΜ-200μΜ的腺嘌呤处理Huh7细胞，处理12小时，对HAMP基因表达的激活作用， 曲线中a、b、c代表不同组之间有统计学意义；
[0016] B:浓度为50μΜ腺嘌呤处理Huh7细胞从Oh到24h对HAMP基因表达的激活作用；
[0017] (：:(^]\1、1(^]\1、2(^]\1、5(^]\1、10(^]\1腺嘌呤处理!111117细胞1211，￥68七6?1131(^检测810 3-SMAD、JAK-STAT通路蛋白水平。
[0018] D:浓度为50μΜ腺嘌呤从Oh至24h处理Huh7细胞对Hepcidin表达通路相关蛋白的影 响，western blot检测BMP-SMAD、JAK-STAT通路蛋白水平。
[0019 ]图2为腺嘌呤显著激活HAMP基因的转录；
[0020] 不同浓度腺嘌呤(0-100μΜ)处理Huh7细胞12h，荧光素酶报告基因检测HAMP基因转 录情况;BMP6作为阳性对照，a、b、c、d表示不同组之间有统计学意义。
[0021 ]图3为腺嘌呤膳食能激活Hfe小鼠体内Hampl基因表达；
[0022] A:腺嘌呤(0.1 % )膳食1个月和两个月，Hfe小鼠肝脏Hamp 1、ID 1表达量情况；
[0023] B:腺嘌呤(0.1%)膳食一个月或两个月，Western Blot检测BMP-SMAD、JAK-STAT和 MEK/ERK通路蛋白水平。
[0024] 图4为加入TGF0通路抑制剂LDN193189和MEK/ERK通路抑制剂U0-126后，Hampl的表 达和相关通路蛋白水平；
[0025] A:加入LDN193189后，Hampl的表达，a、b、c表示不同组之间有统计学意义；
[0026] B:加入U0-126后，Hampl的表达，a、b、c表示不同组之间有统计学意义；
[0027] C:同时加入LDN193189和U0-126后，Hampl的表达，a、b、c表示不同组之间有统计学 意义；
[0028] D:Western Blot检测BMP-SMAD、JAK-STAT和MEK/ERK通路蛋白水平。
[0029]图5为腺嘌呤膳食能显著降低Hfe小鼠的肝脏铁、血清铁、转铁蛋白饱和度等；
[0030] A:腺嘌呤(0.1%)膳食，一个月和两个月，Hfe雄鼠和雌鼠血清铁含量；
[0031] B:腺嘌呤(0.1%)膳食，一个月和两个月，Hfe雄鼠和雌鼠转铁蛋白饱和度；
[0032] C:腺嘌呤(0.1%)膳食，一个月和两个月，Hfe雄鼠和雌鼠肝脏铁含量。 (五)【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0034] 实施例1:
[0035] 1.材料和方法
[0036] 1.1实验原料制备
[0037] Adenine购自SIGMA公司。所有活性单体溶于无菌二甲基亚砜(DMS0)中，配置成所 需浓度。
[0038] 1.2细胞培养
[0039]人肝癌细胞株Huh7由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。培养条件:含10% FBS(GIBCO)的DMEM高糖型培养基(GIBCO)，37°C，5%⑶2饱和湿度培养箱。待细胞生长融合 到70-80%，分别加入DMS0配制的0μΜ、10μΜ、20μΜ、50μΜ、100μΜ和200μΜ的腺嘌呤溶液继续培 养12h，弃上清培养基，PBS漂洗3遍，Trizol法提取RNA，Realtime-PCR检测ΗΑΜΡ基因表达量。 [0040] 1.3Luciferase荧光素酶报告基因检测
[0041 ]按照FuGENE?:HD Transfection Reagent-Promega转染系统说明，于转染前 1 日将人肝癌细胞株Huh7接种于24孔板，5 X 104个/孔，第2日当细胞约60 %融合时，更新细胞 培养液，共同转染1^崖？11'0111(^612.71<：13-。61^3(〇1?&111；[116 1^6 311(101'如1'081&￥1'1'111<：8已， The Scripps Research Institute，La Jolla,CA,USA提供，制备方法参考文献Truksa J, Lee P&Beutler E.Two BMP responsive elements,STAT,and bZIP/HNF4/C0UP motifs of the hepcidin promoter are critical for BMP,SMAD1,and HJV responsiveness.Blood 113,688-695.)和内参1^11丨113报告基因质粒。共转2411后，分别加入0130配制的(^]\1、1(^]\1、 20μΜ、50μΜ腺嘌呤溶液处理12h后，裂解收集细胞，离心取上清，用Dual-Luciferase Reporter Assay System测定裂解细胞上清内Luciferase(HAMP Luc和Renilla Luc)活性， 计算HAMP Luc/Renilla Luc比值。每种处理各个设3复孔。