可从 Invitrogen (英杰)买到）的细胞溶解和蛋白质保存溶液。
[0094] 如果目的是通过细胞学分析细胞，则释放到过滤内容上的溶液例如可以是，防腐 剂缓冲剂，例如可从豪洛捷(Ho 1 ogic)买到的(含有甲醇的保存液(PreservCyt)溶液）；或者 细胞生长培养基，例如，补充有10%的血清(FBS)、1 %的L-谷氨酰胺、100U/ml盘尼西林和 100μg/ml链霉素的细胞培养基(DMEM)。
[0095] 在某些实施例和方法中，本发明的组件可以用于从尿液收集特定无细胞蛋白质， 例如，通过使用由涂有蛋白质A/G的琼脂糖滤珠组成的过滤器，而与有关蛋白质结合的抗体 附着至该琼脂糖滤珠，接着将滤筒放置到储存单元中，并且可选地将诸如磷酸盐缓冲盐水 的等渗缓冲剂释放到过滤内容上。
[0096] 本发明在医学检测、诊断和监控中的应用
[0097] 如本文所描述的用于从生物流体收集生物材料，以及随后的储存和可选地处理所 述生物材料的组件和方法，尤其与疾病和病情的检测、诊断和监控相关联。
[0098] 尽管优选实施例是关于从尿液样品收集细胞，以检测泌尿生殖器癌症，尤其是膀 胱癌，但应理解，通过选择合适的过滤器、装置尺寸以及(如果存在的话)储存单元中的室内 容纳的流体，本文所描述的组件和方法也可以用于检测、诊断和监控各种疾病和病情。例 如，在前列腺癌和肾癌中，存在肿瘤细胞中的基因（诸如GSTP1、VHL、APC RASSFlA、Timp-3) 的甲基化检测，而这些肿瘤细胞来自尿沉淀（Caims等人，癌症自然评论(Nature Reviews Cancer)2007; 7 :531-543)。同样，线粒体DNA的变化检测对于早期癌症检测、疾病进展监控 和治疗反馈可能是有用的，并且体液中存在的剥离肿瘤细胞可为线粒体DNA的一个来源 (Gabriel Dakubo第11章 （Mitochondrial DNA measurement in Exfoliated Cells for Cancer Detection and Monitoring:The copy Number Advantage in Mitochondrial Genetics and Cancer 2010(用于癌症检测和监测的脱落细胞中线粒体的DNA测量:线粒体 基因和癌症中的复制数据优势2010)，第259-274页，ISBN:978-3-642-11415-l (印刷)978-3-642-11416-8(在线））。对尿沉淀中MCM5的提升含量的检测也可以用于预测膀胱癌 (Stober等人，美国国立癌症研究所杂志(J Natl Cancer Inst)2002;94:1071_9)。此外，已 经对从尿沉淀分离出的RNA进行了分析以便诊断肾移植后的急性排斥反应，这为肾活检的 替代提供了潜能（Suthanthiran 等人，N. Engl .J .Med. 2013; 369:20-31)。
[0099] 本发明的组件和方法可以用于捕获尿液或者其它流体中的自由大分子(例如，蛋 白质、DNA、RNA或者代谢分子）。例如，卵巢癌患者的糖基化嗜曙红细胞派生神经毒素、人绒 毛膜促性腺激素的C00H-末端骨调素段和β-亚基核心段、其尿液中的可溶性间皮素相关肽 (SMRP)和Bcl_2水平已经表现出变化(Das and Bast Biomark Med(Das与Bast生物标记医 学杂志）2008;2(3):291-303)。尿液中的310(^6和310(^9蛋白质的检测可以用于检测上消 化道癌(Husi等人，蛋白质组学临床应用（Proteomics Clin Appl) .2011 ;5(5_6) :289-99)， 而尿液中的SAA4和ProEGF蛋白质的检测则可以用于检测膀胱癌(Chen等人，蛋白组学杂志 (Journal of Proteomics)2013,85:28_43)〇
[0100] 本文描述的组件和方法还可以用于收集和过滤其它生物流体，诸如唾液、痰和血 液、以及通过使用更加侵害性方法获取的体液，诸如例如，胸腔积液、灌洗液(例如，导管灌 洗、支气管肺泡灌洗）以及血清，用于分析所捕获的材料，包括通过对与特定疾病和失调(包 括诸如肺癌和乳腺癌的癌症）相关的基因组改变进行检测（Bel insky等人， Proc .Natl .Acad · Sci .USA, 95 :11891-11896，1989 ;Ahrendt等人，J .Natl · Cancer Inst ·， 91:332-339，1999 ;Evron等人，Lancet，357:1335-1336，2001) 〇
[0101] 血液的过滤和浓缩也可以用在对循环肿瘤细胞(CTC)的分离和分析中。CTC的分离 和表征(characterization)是一个技术挑战，这是因为其仅占血液中存在的总细胞的一小 部分。然而，由于CTC反映了肿块内细胞的分子特征，所以其提供了一种潜在的相对的非侵 害性方式来诊断或者监控患者的进展/反馈。已经在诸如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和 结肠癌患者的癌症中识别出了 CTC，其中，已经显示出，CTC在这些癌症中提供了预测信息和 预后信息。在胰腺癌患者中也已经识别出了 CTC，但还没有进行使用CTC来引导临床治疗的 关键研究（Cen等人，生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)2012; 1826:350-356)。从具有前列腺癌、结肠直肠癌和乳腺癌的患者的血液中捕获到循环肿瘤细 胞已经显示出，能够使用利用如下优势的方法:肿瘤细胞的尺寸比正常细胞大。通过选择恰 当的过滤器，本文中描述的组件和方法也可以适用于捕获和分析循环无细胞DNA(cf-DNA)。
[0102] 相应地，本文描述的方法可以涉及如下步骤:对已知的与特定疾病或病情相关联 的标记进行测试。所述标记可以是如本文所描述的和如本领域中文件所记载的基因标记、 基因组改变、蛋白质（例如，抗体)的出现或者含量提升/减少、细菌或酵母菌的出现或者含 量的提升/减少。
[0103] 在本文描述的某些方法中，标记可以是已知的与癌症相关联的标记。癌症可以是 泌尿癌或者妇科癌，例如，膀胱癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、输尿管癌、尿道上皮癌、脐尿管 癌、子宫内膜癌或者卵巢癌。癌症可以是与其它器官相关联的癌症，例如，肝癌、黑素瘤、结 肠直肠癌、头部癌症和颈部癌症、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、或者上消化道癌。癌症可以是转移 性癌症。与这些癌症和其它癌症相关联的标记在本领域中是已知的。在某些优选实施例中， 标记与泌尿生殖器癌症相关联，优选地与膀胱癌、前列腺癌、或肾癌相关联。在某些优选实 施例中，标记与膀胱癌相关联，更加优选地与非肌肉侵害性膀胱癌相关联。
[0104] 在某些实施例中，标记与癌症之外的病情相关联。例如，标记可以与肾移植中的急 性排斥反应相关联，这具有如下优势:潜在地避免了进行侵害性肾活检的需要;或者标记与 细菌和/或酵母菌感染相关联，例如，诸如膀胱炎和肾盂肾炎的尿路感染。
[0105] 还应理解，在本发明的某些方法中，标记本身可以不与疾病或者病情相关联，相 反，可以是与个体或者特定血统相关联的基因标志，例如，用于司法鉴定和亲子鉴定中。
[0106] 样品分析
[0107] 应理解，用于分析过滤内容以及(如果存在的话)溶液(具有过滤内容的过滤器储 存在该溶液中）的方法将取决于生物材料的性质和分析的目的。用于处理材料和/或溶液以 及用于检测有关标记的方法在本文进行了描述并且在本领域中是已知的。
[0108] 本文描述的组件和方法可以与UCyt+?和Urovys ion?成套工具一起使用。这些 系统的问题在于尿液的运输以及细胞数量低和这些样品中的肿瘤细胞的比例低。本文中描 述的提供了恰当的保存方式、细胞离析方式并增加了肿瘤细胞的比例的组件和方法可以改 善使用。在最近的一项研究中，将荧光原位杂交(FISH)分析(UroVysion)与细胞学和膀胱镜 检查进行比较，以作为接续方法，Galvan等人(癌症细胞病理学(Cancer Cytopathol)2011; 119:395-403)注意到：由于样品中的尿道上皮细胞太少或者其它技术原因，所以约10%的 样品不能进行分析。已经在研究中使用追踪蚀刻商用过滤器过滤并结合FISH分析，并且与 使用传统制备方法进行的其它研究相比，这提高了检测的灵敏度（Meiers等人，Arch Pathol Lab Med(病理和实验室医学文献集)2007; 131:1574-1577) Jeiers等人使用了具 有8μπι孔径的过滤器并且发现其在收集上皮细胞上的效果极好。作者认为，灵敏度增加的部 分原因是通过过滤创建了单层细胞制备。然而，本发明的发明者认为，这至少可以部分地归 功于样品中肿瘤细胞比例增加的影响。Meiers等人注意到：与通过传统方法得到的85%的 充足率相比，通过该过滤方法得到的充足率为95%，这显示了FISH分析的稳健性也通过过 滤得到了提高，并且因此通过使用本文提供的组件和方法可以提高稳健性。
[0109]本发明的特殊优势
[0110]本发明的主要应用在于膀胱癌的诊断和监控。本发明研发用于提供简单的方式来 从尿液中捕获膀胱肿瘤细胞并且储存/保存来自这些细胞的DNA以供后续分析。重要优势包 括：
[0111] 1)组件的成本低；
[0112] 2)组件使用简单，使得其适合于在家里使用；
[0113] 3)通过使用容纳有合适溶液的储存单元，在过滤之后立即对生物材料进行处理， 以便在分析之前对样品进行保存和/或处理；
[0114] 4)可以通过基于尺寸的过滤来增加肿瘤细胞的比例，从而提高检测的灵敏度；
[0115] 5)过滤内容(例如，所捕获的细胞)可以通过普通邮递运输至合适的医疗中心或者 测试机构，从而减少了与医疗保障体系接触的需要；
[0116] 6)定期地和重复地采样是没有问题的，以及
[0117] 7)与膀胱镜检查相比，使用该装置来诊断和监控膀胱癌将会改善患者的生活质量 并且极大地降低医疗保健费用。
[0118] 运Μ
[0119] 列出如下示例是为了给本领域的技术人员提供如何实践本发明的完整的公开和 描述，并且不意在限制本发明的范围。
[0120] 微膜过滤器上的细胞的捕获
[0121]下面描述了利用膜过滤器从尿液捕获细胞以进行分析。
[0122]收集样品
[0123] 从承认在丹麦赫乐福医院进行膀胱镜检查和经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)的膀 胱癌患者以及没有已知泌尿恶性肿瘤的健康志愿者收集晨尿样品。将样品送到"丹麦癌症 研究中心"，在收集之后的4-6个小时内，在这里对样品进行处理。
[0124] 尿液样品的处理
[0125] 针对所有患者和对照者，从每种尿液样品取出50ml，通过10分钟2000 Xg的离心分 离进行沉积，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗浮筒(pe 11 et)后，再次进行10分钟的离心分 离。丢弃上层清液并且再次将浮筒悬浮到大约200μ1的PBS中。并行地，将来自相同样品的尿 液抽入一次性注射器，并且通过正向力迫使其通过安装在过滤器保持器中的膜过滤器。使 用直径25nm，孔径8μηι的Whatman Nuclepore追踪蚀刻聚碳酸酯亲水过滤器以及相应的过滤 器保持器。使样品通过过滤器直到饱和，最多为125ml。在从过滤器保持器移除过滤器之前， 使用PBS冲洗过滤器。将尿液沉淀和过滤器均储存在-80°C下，直到进行进一步处理。
[0126] 为了测试储存单元的功能，将滤筒转移至储存盒，储存盒这时安装有盖子，盖子来 自"Oragene DNA自收集成套工具"（盘格式0G-250,加拿大安大略渥太华DAN Genotek公 司）。
[0127] DNA分离和亚硫酸氢盐转化
[0128] 通过"QiaAmp DNA迷你成套工具"（德国希尔登Qiagen GmbH公司）从尿液沉淀和过 滤器分离出DNA。使用ATL缓冲剂和蛋白酶K在56°C下培养过滤器样品和尿液沉淀至少1小时 (过滤器)或者整夜(沉淀）。根据制造商的使用指南来进行随后的处理。来自过滤器和沉淀 的DNA分别在50μ1和100μΙ的缓冲剂AE中进行洗脱并且储存在-80°C下。使用NanoDrop 1000 分光仪来测量DNA浓度。来自16个患者和9个健康对照者的样品包含的DNA不足以用于分析 并被丢弃。
[0129] 使用"EZ DNA Me