一种非小细胞肺癌放疗相关的HIF-1α的抑制剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学药物领域，具体涉及一种miRNA-21抑制剂在制备用于降低非小细 胞肺癌中HIF-la水平的药物的应用。
【背景技术】
[0002] miRNAs是功能性非编码RNAs，20-24个核苷酸，在控制目的miRNAs的稳定性和转录 效率中起重要作用。成熟的miRNA通过对包括目的基因互补序列及包括3'端非转录区域在 内诱导已转录的基因不表达。因此，miRNA异常表达可能影响目的基因的转录，同时进一步 影响与癌症相关的信号通路，涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、变异、迀移和新陈代谢。肿瘤 组织通常表现出功能性miRNA量减少;然而，已有文献显示miRNA-21在癌症发生中发挥作用 (oncomiR)，其高度表达与多种癌症相关，包括胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、 卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、颅脑肿瘤、食管癌和前列腺癌。此外，一项早期研究显示:miRNA-21 在卵巢癌细胞中可以调节紫杉醇的敏感性，表明miRNA-21在药物耐受性中起着重要作用。
[0003] 放射治疗广泛用于各种癌症的治疗。尽管放射治疗广泛应用，使许多肿瘤得以缓 解，但放射治疗失败的突出表现是肿瘤复发，肿瘤复发大多与肿瘤细胞获得了辐射耐受有 关。目前，人类癌细胞放疗抵抗性的详细机制仍不清楚。有报道说磷脂酰肌醇3-激酶/AKT升 高可能代表人类肝癌和宫颈癌出现放疗抵抗的发生。此外，一个早期报道显示miRNA-21高 表达可能导致乳腺癌细胞放疗抵抗性，因此建议目标基因miRNA-21可以作为攻克放疗抵抗 的一种治疗策略。
[0004]大多数癌细胞通过无氧糖酵解进行能量供应，这被称为"瓦博格效应"，然而，与线 粒体呼吸相比无氧糖酵解产生ATP是低效率的。结果，癌细胞吸收过量的葡萄糖并形成大量 的乳酸，这是一个公认的糖降解异常的表现。早期的研究已经表明代谢途径与药物耐药相 关，显示癌细胞的代谢失衡可能是开发一种肿瘤治疗的新途径。
[0005] 缺氧诱导因子-l(HIF-l)是广泛存在于哺乳动物及人体内的一种转录因子，由a和 β两个亚基构成的异二聚体蛋白聚合物，通常情况下，HIF-Ιβ为结构性表达，其水平基本稳 定，而HIF-la受氧浓度的调节并在整个转录过程中起关键作用。缺氧是实体肿瘤微环境特 征之一，当氧浓度过低时，HIF-la表达增加，并通过调控多种靶基因的表达，以适应低氧环 境，在肿瘤生长、浸润和转移过程中具有重要作用。研究表明HIF-la的表达水平升高可导致 放疗疗效降低，然而也有部分文献认为HIF-la并不影响肿瘤细胞的放射敏感性。
[0006] 目前虽然关于肺癌细胞放射增敏性的报道较多，但是在放疗抵抗的非小细胞肺癌 细胞中miRNA-21是如何控制的尚不清楚。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，研究验证了 miRNA-21在放疗抵抗中起到的作用并发 现糖酵解和放疗抵抗的相关性，提供了相应证据表明非小细胞肺癌细胞中miRNA-21调节放 疗抵抗的机制。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明的第一个方面，miRNA-21抑制剂在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF-1α水平的药物中的应用，其中miRNA-21的核苷酸序列为
[0010] 5 ' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 '，如SEQ ID N0 · 1所示。
[0011] 本发明的另一个方面，一种包含miRNA-21抑制剂的组合物在制备用于降低非小细 胞肺癌细胞中HIF-la水平的药物中的应用。
[0012] 优选的，所述非小细胞肺癌细胞具有高HIF-la水平。
[0013] 优选的，所述非小细胞肺癌细胞具有辐射耐受性/放疗抵抗性或者所述非小细胞 肺癌细胞放射敏感性低。
[0014]优选的，所述药物进一步包含药学上可接受的载体。
[0015] miRNA-21抑制剂是指降低miRNA-21的细胞内表达或活性的药物。也就是，药物直 接作用于mi RNA-21或间接作用于mi RNA-21的上调物，以在转录水平降低mi RNA-21的表达、 促进表达的miRNA-21的降解或破坏miRNA-21的活性，从而减少miRNA-21的表达水平或活 性。
[0016] miRNA-21抑制剂通常为生物分子、化合物或植物、动物中的提取物，它们可以使用 本领域的标准技术应用于细胞，比如核酸或者多肽。用于本发明的miRNA-21抑制剂的实例 包括与m i R N A - 2 1碱基序列互补的反义核酸分子，其核苷酸序列为：5 ' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，如SEQIDN0.2所示。与miRNA-21碱基序列互补的反义核酸 分子互补地结合于细胞中miRNA-21的单链片段，以降低miRNA-21的加工效率，从而抑制 miRNA-21的表达以及抑制miRNA-21的活性。本发明的miRNA-21的碱基序列互补的反义核酸 分子可以使用例如化学合成物或重组的标准分子生物学技术分离或制备物，或者通过商业 获得。
[0017] 本发明的反义核酸分子导入细胞引起具有放疗抵抗的非小细胞肺癌细胞中HIF-1 a含量降低。"导入"的含义是将外源DNA或RNA通过转染或转导输送进入非小细胞肺癌细胞。
[0018] 优选的，所述药物可以进一步包含药学上可接受的载体(vehicle)和用药学上可 接受的载体进行配制。只要其确保使本发明的组合物或者miRNA-21抑制剂到达特定的组 织，可以采用任意途径给药。例如，本发明的miRNA-21抑制剂可以口服、直肠、局部及外用、 静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、透皮、鼻内、胸内、眼内或皮内给药。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 由于肿瘤的异质性，并且不同肿瘤处在不同的生存环境，同一肿瘤细胞中分泌的 各种蛋白的调控机理完全不同，多种肿瘤细胞分泌的一种蛋白的调控机理也不完全相同。
[0021] 本发明经过研究发现，非小细胞肺癌中的miR-21的过度表达激活HIF-la，从而刺 激糖酵解酶的表达。当使用本发明所述的miRNA抑制剂，可以降低具有放疗抵抗的非小细胞 肺癌细胞中HIF-la的含量，从而使得非小细胞肺癌细胞的放射增敏性增高，提高非小细胞 肺癌的放射治疗的疗效。
[0022] miR-21抑制剂使具有放疗抵抗的癌细胞恢复放疗敏感性，可通过抑制糖酵解介导 HIF-la，根据本发明的应用，为探讨miR-21调节HIF-la详细机制奠定了良好的基础，更有利 于提尚肺癌的疗效。
【附图说明】
[0023]图1A~图lC:miR-21在辐射耐受癌细胞中上调，并且与放疗抵抗性呈正相关。图 1A:来源于A549肺癌细胞中的辐射耐受细胞的产生，为了产生放疗抵抗癌细胞，在常规细胞 培养条件下，对亲代细胞逐渐增加放射剂量，剂量条件:辐射剂量为〇，2，4，6，8和10Gy，剂量 速率为2Gy/min，检测每个剂量下放疗抵抗克隆情况，放疗抵抗性*P<0.05和*P<0.01。图 IB: A549亲代细胞和放疗抵抗细胞中的miR-21表达水平，辐射敏感性*#P<0.001。图1C:转 染miR-21前体的A549亲代细胞经过48h，随后在0、1、5和10Gy作辐射处理，剂量速率为2Gy/ min，然后做细胞生存分析，对照组*P〈0.05和**P〈0.01。计算数据为平均值土标准误差。 [0024]图2A~图2C:辐射耐受细胞具有上调糖酵解的作用。图2A:检测A549亲代细胞和辐 射耐受细胞中的葡萄糖消耗量和乳糖生成量；图2B:放疗抵抗性细胞和亲代细胞采用免疫 印迹检测己糖激酶(HK)II、丙酮酸激酶(PK)M2和乳酸脱氢酶(LDH)A的上调蛋白质的表达， β-肌动蛋白作为对照组。图2C:在A549亲代细胞和放疗抵抗性细胞中，采用定量逆转录-聚 合酶链式反应检测HKII、PDK1和LDHA的mRNA表达水平。数据作为三个独立实验的平均值土 标准误差。放射敏感性***P<〇 · 001。
[0025] 图3A~图3D:miR-21通过调控HIF-la来上调糖酵解过程。图3A:A549细胞转染miR- 21，48h，收集细胞然后采用免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为对照组。图3B:转染miR-21后，检 测A549细胞和对照组的细胞中的葡萄糖的消耗量和乳酸产生量，对照组***P<0.001。图 3C:采用免疫印迹检测，随着小干扰RNA对转染细胞中的HIF-la的干扰，HIF-la在转染miR-21 的细胞和对照细胞的表达水平下调， β_ 肌动蛋白作为对照组。图 3D: 葡萄糖的消耗量和乳 酸的生成量的检测，对照组miR、前体miR-21或者是前体miR-21加siHIF-la，计算数据为平 均值土标准误差，***P<0.001，ΗΚ Π :己糖激酶2、PKM2、丙酮酸激酶M2，LDHA:乳糖酸脱氢 酶。
[0026]图4A~图4D: miR-21的抑制剂抑制糖酵解和增强A549细胞的放射敏感性。图4A:转 染对照组miRNA或反义的miR-21，测其在A549细胞的表达水平；图4B:葡萄糖消耗量和图4C: 乳酸生成量，在转染对照组miRNA或反义的miR-21的细胞中，对照组*P〈0.05，**P〈0.01 和*#P〈0.001;图4D:转染对照组miRNA或反义的miR-21的A549亲代细胞，转染时间48h，然 后进行照射处理，剂量:0，0.5，1，2，4 and 6Gy，剂量速率2Gy/min，然后显示细胞生存分析。 反义miR-21*P〈0.05，计算数据为平均值土标准误差。
[0027] 图5A~图5D:复敏的放疗抵抗性细胞通过抑制miR-21来调控HIF-la。图5A:miR-21 在转染了对照miRNA或