蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于蟾酥提取物的纳米制剂在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用，属 于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 人脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的一种最常见的原发性颅脑 肿瘤，约占颅内肿瘤的35%~61%，其侵袭性强，预后差，是病死率和致残率都较高的恶性肿 瘤。人脑胶质瘤在发病之初，通常没有典型的症状，并且由于胶质瘤位于重要功能区及深部 的侵袭性生长特征，使其难以全切，对放化疗也不甚敏感，非常容易复发。而化学药物和一 般的抗肿瘤中药，因很难同时具有杀伤人脑胶质瘤细胞和透过血脑屏障两方面作用，疗效 也不理想，导致人脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。因此，研发相对高效 低毒的新型抗人脑胶质瘤化疗药物成为临床上亟待解决的问题，同时也是当前世界研究的 前沿课题和热点领域。
[0003] 蟾酥一词来源于《本草衍义》，是由两栖纲无尾目蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾餘（Bufo melanostictus Schneider)等的耳后腺及 皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥而成。蟾酥包含多种化学成分，按溶解性质分为两大类， 一类为水溶性部分，包括一定量的吲哚类生物碱(5-羟色胺、蟾蜍色胺、蟾酥季胺等）、多糖 类、有机酸和氨基酸等成分;一类为脂溶性部分，约占20%，具有留体结构，统称为蟾蜍甾类， 蟾蜍留类又分为与辛二酰精氨酸结合的酯即蟾蜍毒素以及游离的蟾毒配基两大类。我国第 一部本草专著《神农本草经》中就记载"蟾酥味辛、寒，主邪气，破庙坚血，痈肿，阴疮，服之不 患热病"，有解毒、止痛、开窍醒神、抗肿瘤等功效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供基于蟾酥提取物的抗人脑胶质瘤药物一一蟾毒配基纳米 制剂(bufadienolides nano preparation, BU-NP)在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用。
[0005] 本发明实现过程如下： 蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量大于90%的蟾酥提取物在制备治疗人脑胶质 瘤药物中的应用，所述蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量比为2:3:5。
[0006] 蟾毒配基包括蟾毒灵、蟾毒它灵、蟾毒它里定、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵、脂蟾毒配 基、日蟾毒素、日蟾蜍毒配基、沙蟾毒精、远华蟾毒精及南美蟾毒精等20余种蟾毒配基。
[0007] 蟾毒配基很不稳定，在水中几乎不溶，加之其毒性较大，给药后半衰期短，消除迅 速，体内分布广泛，同时会引起室性早搏等心脏不良反应，导致蟾酥制剂的开发具有一定难 度。为解决上述问题，本发明将蟾酥提取物制备成纳米制剂，包括蟾毒配基固体脂质纳米 粒、蟾毒配基纳米脂质体、蟾毒配基亚微乳、蟾毒配基纳米囊、蟾毒配基纳米球、蟾毒配基纳 米乳或蟾毒配基聚合物胶束，纳米制剂的粒子尺寸为1~l〇〇〇nm。
[0008] 本发明纳米制剂中含蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的浓度和为0.001~5mg/ mlo
[0009] 纳米制剂具有双重杀伤肿瘤细胞的能力，除诱导细胞凋亡外，还可作为细胞自噬 促进剂，通过诱导细胞凋亡和自噬两种方式共同作用杀伤人脑胶质瘤细胞。本发明纳米制 剂通过产生ROS介导JNK的活化诱导人脑胶质瘤细胞的自噬。
[0010] 本发明采用人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型进行体内实验，BU-NP静脉注射后 可与大脑毛细血管内的内皮细胞结合，将药物透膜传递入脑或是通过吸附介导包吞转运作 用，提高药物的脑靶向性，使蟾毒配基在脑中的分布进一步增加，从而显著延长裸鼠的带瘤 生存期，且具有良好的量效关系。通过活体动物体内荧光成像技术检测肿瘤的信号强度、核 磁共振扫描技术检测肿瘤的体积大小，结果表明BU-NP体内抑瘤效果优于等剂量普通的蟾 酥提取物溶液剂(bufadienolides solution, BU-S)而心脏毒性低于BU-S，且与临床目前 正应用的药物比无显著性差异。以上证实了蟾毒配基纳米制剂具有优于普通的蟾酥提取物 溶液剂抗人脑胶质瘤的优势，可用于制备治疗人脑胶质瘤的药物，对人脑胶质瘤的治疗及 预后可起到良好的效果。
[0011] 通过流式细胞术和western blot方法分别测定经BU-NP处理后U87-MG细胞内ROS 产生以及LC3，p-JNK和JNK表达的变化，确定了BU-NP可作为细胞自噬促进剂，通过诱导细 胞自噬杀伤人脑胶质瘤细胞，并且作用机制与ROS的产生及JNK的活化有关。
[0012] 用JNK抑制剂（SP600125)或抗氧化剂（NAC)预先处理U87-MG细胞后再给与BU-NP， 流式细胞术检测细胞内ROS水平，western blot方检测定p-JNK JNK及LC3的表达，最终确定 了ROS能介导JNK的活化，BU-NP诱导的U87-MG细胞自噬是通过增加 ROS从而激活JNK实现 的。
[0013] 本发明的优点在于:①本发明提供了基于蟾酥提取物的抗人脑胶质瘤药物一一蟾 毒配基纳米制剂，其中抗肿瘤活性成分蟾毒配基的纯度大于90%，蟾毒配基浓度高达5mg/ ml，这是目前上市的蟾酥制剂所达不到的。②本发明提供的蟾毒配基纳米制剂可增加蟾毒 配基在脑中的分布，而避免被心脏摄取，从而提高了药物的脑靶向性而降低了心脏毒性。与 普通的蟾酥提取物溶液剂相比，蟾毒配基纳米制剂脑胶质瘤治疗效果更强，副作用更少，从 而提升了蟾毒配基的使用价值，为胶质瘤的治疗提供了一种新的药物。③本发明打破了目 前人们对"蟾毒配基杀伤脑胶质瘤细胞的作用仅是通过诱导细胞凋亡实现的"这一局限性 的认识，证明了蟾毒配基纳米制剂具有双重杀伤人脑胶质瘤细胞的能力，除诱导细胞凋亡 外，还可作为细胞自噬的促进剂，通过诱导细胞凋亡和过度自噬两种方式共同作用杀伤人 脑胶质瘤细胞。④本发明拓宽了蟾毒配基的作用机制，除阐明蟾毒配基纳米制剂诱导的 U87-MG细胞自噬与产生ROS、活化JNK有关外，还揭示了ROS和JNK的上下游关系，明确了BU-NP诱导的U87-MG细胞自噬是通过增加 ROS从而介导JNK的活化实现的。这将在研究脑胶质 瘤的发病机理、临床诊断以及临床治疗的个体化用药方面发挥重要作用。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明不同给药组裸鼠治疗后的体重变化比较图，图中横坐标为不同给药 组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性 药temozo lomide (TMZM)组，每组均包括造模前裸鼠体重，造模后14天裸鼠体重及连续给药 10天后裸鼠体重;纵坐标表示不同组别裸鼠的体重变化； 图2为本发明不同给药组裸鼠的带瘤生存期比较图，图中横坐标为不同给药组，从左 到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM 组，纵坐标表示不同组裸鼠带瘤的生存时间； 图3为本发明活体动物体内荧光成像检测不同给药组裸鼠体内肿瘤信号强度图，图中 横坐标为不同给药组，从左到右依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取 物水溶液组和阳性药TMZM组，纵坐标表示荧光成像检测出的不同组别裸鼠体内肿瘤信号强 度； 图4为本发明不同给药组裸鼠的肿瘤抑制率图，图中横坐标为不同给药组，从左到右依 次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组，纵坐 标表示不同组别裸鼠的抑瘤率； 图5为本发明不同给药组人脑胶质瘤的病理学检查图（HE染色，X 200)，图中从左到右 依次为模型组，蟾毒配基纳米乳低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组和阳性药TMZM组； 图6为本发明人脑胶质瘤S-100和GFAP蛋白的免疫组化染色图（X 400)，图中S-IOO(-) 和GFAP(-)为正常脑组织中S-100和GFAP蛋白的表达，S-100(+)和GFAP( + )为肿瘤组织中S-100和GFAP蛋白的表达； 图7为本发明蟾毒配基纳米脂质体和蟾酥提取物水溶液对人脑胶质瘤U87-MG细胞的增 殖抑制作用示意图，图中横坐标是蟾毒配基纳米脂质体和蟾酥提取物水溶液的药物浓度， 纵坐标是对U87-MG细胞生长的抑制率，图中的三条趋势线从下往上依次为不同浓度药物作 用24h、48h和72h; 图8为本发明蟾毒配基纳米球对U87-MG细胞凋亡的影响在双变量流式细胞仪的散点 图，其中，横坐标是Annexin V，纵坐标是PI，左下象限是活细胞，右下象限是凋亡早期细 胞，右上象限是凋亡晚期细胞及自噬坏死细胞，细胞总死亡率为右下及右上象限之和。四幅 图依次是蟾毒配基纳米球低、中、高剂量组和对照组； 图9为本发明蟾毒配基纳米囊对U87-MG细胞LC3-II和Beclin-I蛋白表达的影响，图中 从左到右依次为对照组，蟾毒配基纳米囊低、中、高剂量组，蟾酥提取物水溶液组，从上到下 依次是LC3-II、Beclin_l和β-actin蛋白的表达； 图10为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对自噬体形成的影响，图A为透射电镜下观察 所见对照组细胞，Ba为蟾毒配基固体脂质纳米粒处理细胞后透射电镜下可见凋亡小体，Bb 为蟾毒配基固体脂质纳米粒处理细胞后透射电镜下可见自噬体； 图11为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞产生ROS的影响，图中横坐标 是蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞的作用时间，从左到右依次为0、12、24、48h，纵坐 标是产生ROS的相对荧光相对密度； 图12为本发明蟾毒配基固体脂质纳米粒对U87-MG细胞JNK及其磷酸化水平表达的影 响，图中从左到右蟾毒配