使用奈福泮化合物治疗瘢痕和β-联蛋白介导的疾病的方法
【专利说明】
[00011 本分案申请是基于申请号为201080057504.7，申请日为2010年12月15日，发明名 称为"使用奈福泮化合物治疗瘢痕和联蛋白介导的疾病的方法"的原始中国专利申请的 分案申请。
技术领域
[0002 ]本发明主要涉及瘢痕和β-联蛋白介导的疾病的治疗。
【背景技术】
[0003] 纤维增生进程是一组特征在于间质成纤维细胞样梭形细胞过度增生的疾病。它们 范围涵盖了从肥大性伤口到诸如侵袭型纤维瘤病(AF)的肿瘤进展。
[0004] 在伤口愈合的过程中，几种细胞类型和信号通道被活化从而重组皮肤的上皮和真 皮层。在皮肤损伤之后，开始三个连续不同的但相重叠的进程:炎症、增生和重塑。在增生 期，间质成纤维细胞样细胞聚积在皮肤的表皮组分中而上皮细胞屏障层被改造 （Singer 1999,Martin 1997 ,McClain 1996)。0_联蛋白已经显示出调节上皮和间充质细胞活性，因 此它能促进表皮间充质细胞的增生和分化和减少上皮角蛋白细胞的转移(Cheon 2002)。小 鼠模型已经表明β-联蛋白能够调节最终伤口的大小，而由锂处理所诱导的β-联蛋白水平导 致更大尺寸的伤口愈合(Cheon 2006)。并且，在四环素调节的促进子控制之下的，在间充质 细胞中表达稳定联蛋白的转基因鼠已经被生产出来。将有增生性皮肤伤口的已经愈合的 受伤小鼠与野生型对照小鼠相比较(Cheon 2002)。这表明β-联蛋白在间充质细胞中的重要 性和它在伤口愈合中的决定性作用。
[0005] 另一种β-联蛋白介导的纤维增生疾病为侵袭型纤维瘤病(AF)，也被称作硬纤维 瘤。AF是一种局部侵袭型软组织肿瘤，包括间质成纤维细胞样梭形细胞。AF作为零星病灶或 者诸如家族性多发性腺癌(FAP)的家族性综合征而发生。β-联蛋白稳定作用普遍出现在AF 中，其通过提高的β-联蛋白水平和增加的β-联蛋白-介导的转录活性表现出来。此外，β-联 蛋白稳定作用足以引起AF，如在使用β-联蛋白稳定型过度表达的基因小鼠模型中所示的 (Cheon 2002)。这暗示了β-联蛋白在纤维增生疾病中的关键作用和它在间充质细胞中的重 要性。
[0006] 除了 β-联蛋白在纤维增生疾病中的作用之外，大量研究已经表明β-联蛋白表达失 调在诸如结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、髓母细胞瘤、毛母质瘤和前列 腺癌的大量恶性肿瘤的起源中是重要事件。联蛋白变异在这一组癌症的进展中表现为关 键步骤，这表明它在细胞增生或者细胞死亡的控制中的重要作用（如Polakis Ρ.The many ways of Wnt in cancer .Curr Opin Genet Dev. 2007年2月；17(1) :45-51 所描述的）。
[0007] 考虑到上述情况，有望研发出有效治疗可能与β_联蛋白相关的病况和疾病的新方 法。
[0008] 发明概述
[0009] 现在已经发现奈福泮及其类似物，对于治疗如纤维增生疾病的β-联蛋白介导的疾 病以及治疗瘢痕组织有益。
[0010] 相应地，在本发明的一个方面，提供一种在哺乳动物中治疗β-联蛋白-介导的疾病 或者病况的方法，包括向哺乳动物施用奈福泮，或其功能上相当的类似物、前药、盐或者溶 剂化物。
[0011] 在发明的另一个方面，一种治疗瘢痕组织或者减少瘢痕组织形成的方法包括向组 织施用治疗有效量的奈福泮，或其药学上可接受的类似物、盐、溶剂化物或者前药。
[0012] 在可选择的一个方面，提供了一种产品，其包括包装和包括奈福泮或其功能上相 当的类似物、盐、溶剂化物或者前药的组合物。
[0013] 在另一个方面，提供了奈福泮或其功能上相当的类似物、盐、溶剂化物或者前药的 新用途，用于制备治疗联蛋白-介导的疾病或者病况或者瘢痕组织的药物。
[0014] 附图简述
[0015] 本发明现在将参考下图被进一步描述：
[0016] 附图IA为柱形图，其表明在用DMSO(对照）或者奈福泮处理后使用SRB分析所测量 得到的所培养的标准成纤维细胞和所培养的来自于两个增生性伤口的细胞的活性。以平均 值和95 %置信区间给出细胞存活百分比。与DMSO对照的增生性伤口细胞培养物相比，用奈 福泮处理的培养物中细胞存活百分比有显著的降低，然而，在正常成纤维细胞培养物中的 细胞存活率仍相对无变化(星号表明相比于正常成纤维细胞培养物的显著性）。
[0017] 附图IB是在增生性伤口细胞培养物中β-联蛋白水平的蛋白质印迹分析。相比于 DMSO处理的对照组，奈福泮治疗组表现为大量减少β-联蛋白的水平。
[0018] 附图2是比较用奈福泮未处理（左侧）的或者处理过的或者DMSO对照组的雄性Apc +/Apcl638N小鼠中侵袭型纤维瘤病(AF)肿瘤形成的数量的图表，其图示了在同样处理条件 下胃肠道上段中来自上皮的息肉数量。1)未处理(n=ll)，2)0.1%DMS0(n=10)jP3)& 40mg/kg体重的奈福泮(n = 10)。
[0019]附图3A为在用0.1 %DMS0(对照）或奈福泮之一处理5天后来自于人类侵袭型纤维 瘤病（AF)肿瘤的原代细胞培养物的提取物（n = 5)中的β-联蛋白水平的蛋白质印迹 (92kDa)。也在利用Wnt3a同时有或者没有奈福泮进行培养的原代成纤维细胞培养物中测定 联蛋白水平。实验以三份量进行。肌动蛋白表达被表示为裂解物内参对照。
[0020] 附图3Β是蛋白水平数据的光密度分析的图表，其表明利用0.1%DMS0(对照）或者 奈福泮进行处理的来自于人类AF肿瘤的细胞培养物中的β-联蛋白总水平减少近五倍。显示 为平均值和95%置信区间。相比于对照组在统计上的显著性差异(ρ〈0.05)，利用星号进行 表不。
[0021] 附图4Α是表示利用DMS0(n = 5)或者奈福泮(η = 5)处理了5天的来自于人类AF肿瘤 原代细胞的细胞活性的平均值和95%置信区间的图表。通过利用锥虫蓝染料染色细胞并清 点所有活着(透明）和死亡(蓝色)细胞数量来测量细胞活性。奈福泮显著减少活细胞数量而 死亡细胞的数量并未改变。相比于对照组在统计上的显著性差异(Ρ〈〇.05)，利用星号进行 表不。
[0022] 附图4Β为一个图表，其表示BrdU-阳性/DAPI-阳性细胞相比于总DAPI-阳性细胞的 百分比，其作为利用DMSO或者奈福泮以三份量处理5天后的来自于人类侵袭型纤维瘤病肿 瘤(η = 2)的原代细胞培养物中增生的度量。奈福泮显著减少BrdU进入细胞。显示为平均值 和95%置信区间。相比于对照组在统计上的显著性差异(p〈0.05)，利用星号进行表示。
[0023]附图5A表示提取自永生人类成纤维细胞裂解物的蛋白质印迹分析。观察到相比于 利用DMSO处理的细胞在奈福泮处理过的细胞中β-联蛋白水平显著减少。GAPDH表达被表示 为裂解物内参对照。
[0024]附图5Β为与附图5Α的蛋白质印迹数据相一致的光密度法数据的图表。
[0025]附图6Α为Tcf小鼠受伤14天后伤口的细胞培养物中β-联蛋白的蛋白水平的蛋白质 印迹分析。GAPDH表达被表示为裂解物内参对照。
[0026]附图6Β为用与载体一同配制的奈福泮(奈福泮)或者仅有载体(对照）处理后的有 全层环形伤口的小鼠正常瘢痕大小的图表，其中通过每日40mg/kg系统性给药两周进行处 理。该图表表示使用4mm活检穿孔器所产生的皮肤伤口表面积直径的平均值和95%置信区 间。相对于对照处理，奈福泮处理后伤口的直径明显更小(星号表示显著性差异）。
[0027]附图7是线形图，其表示正常伤口愈合（正常）过程中一段时间后（以周记)和在增 生性伤口（增生）中，相比于未受伤组织的相对的联蛋白的蛋白水平。在正常伤口愈合过 程中联蛋白的蛋白水平的上升和下降正常模式在增生性伤口中是失调的，其展示出联 蛋白水平提高的时间显著延长。
[0028] 附图8为受伤四周后皮肤增生性瘢痕表面积直径的平均值和95%置信区间的图 表。使用活检穿孔器产生4mm直径的全层环形伤口。伤口直径以mm给出。星号表示相比于 TGF-β处理时在所记录的瘢痕大小中的统计学显著性差异(p〈0.01)，其中当受伤时注射 TGF-β已知会引起增生性瘢痕尺寸增大。
[0029] 附图9为在三种不同载体中的不同浓度奈福泮局部制剂的图表：羧甲纤维素 (CMC)、矿脂和羧丙甲纤维素。这三种载体在