Phf14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法

Phf14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物模型技术领域，具体地说，是一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤 及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法。
【背景技术】
[0002] 急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的临床特征表现为肾功能在数天内的急 剧下降。其主要病因是肾缺血再灌注损伤，脈毒症、肾毒性药物打击及肾后梗阻。AKI镜下病 理通常表现为肾小管上皮细胞坏死脱落，肾小管腔内管型形成，间质炎细胞浸润。动物实验 和前瞻性临床研究均发现，经历AKI打击的肾脏即使短期肾功能可W恢复，今后进展到慢性 肾脏病(C虹onic kidn巧disease C邸)的风险也大于未发生过AKI者。由AKI进展到W肾小 管间质纤维化为病理特征的C邸具体机制尚不明确，可能与AKI发生后局部修复性过程的慢 性失衡及其与对抗性因子复杂的相互作用有关。运类修复性进程主要包括细胞周期在损伤 后的阻滞，缺氧诱导因子的分泌，和TGF-beta信号通路的激活等。2012年Ki化gawa等研究人 员发现一种W血小板源性生长因子受体alpha(PDGFR-al地a)依赖性的方式调节细胞间质 分泌的蛋白PHF14(NM_014660.3)，并制作了 PHF14基因非条件敲除小鼠模型。动物模型证明 PHF14非条件敲除具有致死性，小鼠只能在出生后存活不到24小时。死因为严重的肺纤维化 造成的呼吸衰竭。尸检提示肝和肾都有明显的纤维化。体外实验证明PHF14可负向调节 PDGFR-alpha的表达，从而抑制成纤维细胞的细胞外基质分泌。化；Uagawa M,化kebe A,化O Y,et al.Phfl4,a novel regulator of mesenchyme growth via platelet-derived growth factor(PDGF)receptor-alpha.The Journal of biological chemistry.Aug 102012; 287(33): 27983-27996.)由此说明PHF14基因在胚胎发育阶段各器官细胞外基质形 成平衡中起重要调节作用。但是关于PHF14基因在成年阶段与纤维化相关性疾病的关系目 前还未阐明。为了研究该基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中所起的作用，需 要一种在PHF14基因敲除背景下急性肾损伤及损伤后纤维化的动物模型的建立方法，该方 法目前也未见报道。

【发明内容】

[0003] 现有的制作PHF14基因敲除小鼠的方法皆为非条件性敲除，由于该基因敲除具有 致死性，所W无法利用非条件敲除的小鼠模型研究该基因与成年期肾纤维化的关系。而在 现有的广泛使用的肾纤维化疾病动物模型中虽可观察PHF14基因的表达变化，却无法探究 其在疾病发病机制中的作用。故欲研究该基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中 所起的作用，需要建立一种在成年期条件敲除PHF14基因的动物模型，在此遗传背景下进行 急性肾损伤及损伤后纤维化的研究。根据实验需要，叶酸刺激性肾病模型能够模拟临床急 性肾损伤病程，刺激后肾纤维化发生比例较高，并且能够连续监测肾功能。
[0004] 本发明的目的在于建立一种在成年PHF14敲除遗传背景下完全模拟临床病程的急 性肾损伤且损伤后肾纤维化动物模型的方法。
[0005] 根据现有研究成果可知胚胎期全身敲除PHF14会造成各主要器官的明显纤维化， 而在胚胎期器官形成W后的成年期敲除该基因是否有相同效果尚不可知。本发明证明了在 器官形成W后敲除PHF14无明显病理表型，证明该基因在胚胎期的功能结论不可直接推至 成年动物。然而成年期动物的肾脏遭到损伤性打击后，启动和激活了一系列修复相关基因， 其中包括PHF14。在此种情形下PHF14基因功能无法表达会导致肾纤维化加剧。
[0006] 本发明的第一方面，提供一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化 动物模型的建立方法，包括W下步骤：
[0007] A、phf 141ox+/+小鼠与tamoxifen诱导Cre表达小鼠（Cre-ER?)杂交，子一代筛选 地fl41ox+/-;Cre+小鼠；
[000引 B、将步骤A得到的地fl41ox+/-;Cre+小鼠进行自交，子二代中筛选出地fl41ox+/ + ; Cre+小鼠；
[0009] C、将步骤C得到的phfl4lox+/+;Cre+小鼠饲养至8-l2周，接受连续5天1:amoxifen 腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油（sigma)，tamoxifen在玉米油中的终浓度为 7.5mg/mL；
[0010] D、第6天给予叶酸溶液腹腔注射，剂量250mg/kg体重，即得所述的急性肾损伤及损 伤后小管间质纤维化动物模型。
[0011] 所述的步骤D中叶酸溶液为叶酸溶于0.3mol/L Na肥化中，使叶酸终浓度为lOg/L。 叶酸由大连美仑公司提供。采用化H0)3作溶剂是因为叶酸是难溶于水的，其他溶剂无法溶 解。采用的注射剂量过小无法诱导出来急性肾损伤，剂量过大容易致死。
[0012] 所述的phfl41oxp+/+小鼠的制备方法可参照：Huang Q,Zhang L,Wang Y,et al.Depletion of PHF14,a novel histone-binding protein gene,causes neonatal lethality in mice due to respiratory failure.Acta biochimica et biophysica Sinica.Aug 2013；45(8):622-633.
[001引所述的tamoxifen诱导Cre表达小鼠（Cre-ER?)由美国JAX实验室提供（B6. Cg-Tg (Cre/Es;rl)5Amc/J mice(stock 004682))。
[0014] 所述的筛选地fl41ox+/-;Cre+小鼠和地fl41ox+/+;Cre+小鼠的方法：PHF14基因 与化e基因分别鉴定，PHF14鉴定所用引物：
[0015] PHF14-loxp Fa 3，-c1:attttcttgat1:a1:agatgcag-5,（SEQ ID NO. 1);
[0016] PHF14-loxp Ra 3'-gccttctaagttccagc1:actag-5'（沈Q ID N0.2);
[0017] PCR 程序 95 度 lmin，40*(95 度 3〇3,58度3〇3,72度1111111)，72度5111111，结果判定:*1^^ = 356bp，wt/f l〇x = 356bp+457bp，f lox/f lox = 457bp。
[001引化e鉴定所用引物：
[0019] Cre F 3'-attgctgtcacttggtcgtggc-5'（SEQ ID N0.3);
[0020] Cre R 3'-ggaaaatgcttctgtccgtttgc-5'（沈Q ID N0.4);
[0021] PCR 程序 94 度 5min，35*(94 度 2〇3,55度3〇3,72度3〇3)，72度5111111，结果判定:巧非月 性。Cre+ = 200bp。
[0022] 本发明的第二个方面，提供采用上述方法建立的PHF14基因敲除合并急性肾损伤 及损伤后肾纤维化动物模型。
[0023] 本发明的第S个方面，提供上述PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维 化动物模型的建立方法，和上述方法建立的PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤 维化动物模型，在制备或筛选急性肾损伤或损伤后肾纤维化的药物中的应用。
[0024] 本发明的第四个方面，提供一种筛选急性肾损伤或损伤后肾纤维化药物的方法， 包括W下步骤:首先采用上述的方法建立PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维 化动物模型，然后利用制备得到的动物模型筛选对于急性肾损伤或损伤后肾纤维化具有治 疗效果的药物。
[00巧]本发明优点在于：
[00%] 1、本发明建立了一种成年条件PHF14基因敲除的基因背景下的肾损伤后纤维化模 型，为研究PHF14基因在纤维化疾病中的作用提供必备条件；
[0027] 2、与现有制作PHF14敲除的模型相比（如Kitagawa)，本发明的PHF14条件敲除不会 造成胚胎致死性，在成年期tamoxifen诱导敲除PHF14经验证不会造成致死后果，与未敲除 组相比，敲除组肺，肝，肾无显著病变（图9、图10和图11)，运保证了后续急性肾损伤模型制 作不受系统性疾病状态的干扰，可W单独研究该基因缺陷在肾纤维化发病机制中的作用。
[0028] 3、在PHF14基因缺陷的遗传背景下，选择叶酸性肾病作为肾损伤造模刺激原因是 该模型能模拟临床急性肾损伤及损伤后纤维化病程，并且能在不同时间点监测肾功能；与 此相对，常用的采用单侧输尿管结扎模型则无法监测肾功能变化，也就无法在肾功能水平 上验证模型制作情况和该基因对肾功能的影响。
【附图说明】
[0029] 图1.叶酸刺激后不同时间小鼠血肌酢FA Od叶酸刺激0天;FA 2d叶酸刺激2天;FA 14d叶酸刺激14天;FA 28d叶酸刺激28天*与FA Od比较於0.05。
[0030] 图2.叶酸刺激后不同时间小鼠血尿素氮FA Od叶酸刺激0天;FA 2d叶酸刺激2天； FA 14d叶酸刺激14天;FA 28d叶酸刺激28天*与FA Od比较1)<0.05。
[0031 ] 图3.叶酸刺激小鼠0，2，14,28天肾脏PHF14表达变化。
[0032] 图4. tamoxifen诱导PHFl 4敲除后，肾脏PHFl 4表达下调。
[0033] 图5.PHF14未敲除小鼠与PHF14敲除小鼠在给予叶酸（FA)后不同时间点的 collagen 1，al 地 a-SMA，TGF-beta 表达情况。
[0034] 图6不给予叶酸组小鼠肾(A)及给予叶酸2(B) ,14(C) ,28(D)天肾脏Masson染色。 [00巧]图7.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组小鼠（B)肾脏masson病理，可见两组肾脏都 没有明显病理变化。
[0036] 图8.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)肝天狼星红染色，可见纤维化程度无差 异。
[0037] 图9.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)肺masson染色，可见纤维化程度无差 异。
[003引图10.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28天时肾masson染 色。
[0039] 图11.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28天时肾collagen 1 免疫组化。
[0040] 图12.PHF14未敲除组(A)和PHF14敲除组(B)给予叶酸(FA)后28天时肾alpha-SMA 免疫组化。
【具体实施方式】
[0041 ]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0042] 实施例1
[0043] -、材料与方法
[0044] 1. AKI动物模型的制备及分组：IVC级成年巧7化/6野生型小鼠8~12周龄，体重20-35g，由美国JAX实验室提供，饲养于第二军医大学实验动物中屯、。按随机数字表法将20只动 物分为4组（甲-下），每组5只。乙-下组所有动物给予叶酸(溶于0.3mol/L化肥化中，使叶酸 终浓度为lOg/L)腹腔注射，剂量250mg/kg体重，叶酸由大连美仑公司提供。甲组动物给予 0.3mol