神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及神经生长因子缓释微球制剂及其制备方法，属于药物制剂领域。
【背景技术】
[0002] 神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是一种具有神经元营养和促进突起生 长双重生物学功能的小分子多肤类神经营养因子，具有较强的促细胞分裂功能，对中枢及 周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
[0003] 目前，神经生长因子可用于视神经损伤、脑、脊髓损伤、脊髓移植、骨科四肢神经损 伤、坐骨神经损伤、多发性神经炎、椎间盘痛、神经断裂及退行性病变。但在实际应用中，由 于神经生长因子的半衰期较短，在水溶液中易失活，且易受湿度、酸碱度等多种因素的影 响，在神经再生及治疗疾病的漫长过程中，神经生长因子不能长时间持续发挥促再生作用， 需要频繁给药才能实现良好的治疗效果，制备神经生长因子的长效缓释微球制剂是改善上 述问题的有效途径。现有常用的制备微球方法是复乳法(W/0/W)，虽然操作简单，但针对制 备神经生长因子的缓释微球制剂还存在如下的问题：
[0004] 一、研究报道，神经生长因子主要是W二聚体的形式发挥药效，而单体的形式虽然 活性没有完全丧失，但药效显著降低。现有制备微球的方法中，采用了添加药物稳定剂的方 法保护药物的活性，但微球在冻干、储存和释放时，特别是冻干与存储过程中，由于蛋白药 物受到强烈的外界应力作用(包括低溫应力，抑的改变，离子强度增加等），蛋白药物的结构 和活性遭到破坏。蛋白二聚体容易发生解聚，影响蛋白活性。
[0005] 二、药物稳定剂的含量不仅影响药物活性也会影响药物释放，而现有方法常常为 了保护药物活性加入浓度过大、含量较高的药物稳定剂(大部分在内水相的浓度超过0.1 g/ ml)。虽然药物的活性得到一定的保护，但较高的内水相渗透压，会进一步影响药物释放行 为，可能引起高突释（突释率大于15%)、释放过快或过慢、释放不完全(在理论释放期内积 累释放率低于80%)等，降低药物的治疗效果。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种突释率低、缓释性好、蛋白活性持久 的神经生长因子长效缓释微球制剂。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供上述神经生长因子长效缓释微球制剂的 制备方法。
[000引为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0009] 神经生长因子缓释微球制剂，由W下重量百分比含量的成份组成：神经生长因子 0.01~2.00%，两嵌段两亲性聚合物40.00~99.88%，稳定剂0~40.00%，冻干保护剂0.10 ~50.00%;稳定剂选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、簇甲基葡聚糖、环糊精或聚乙二醇中 的一种或多种;冻干保护剂选自薦糖、甘露醇、海藻糖、泊洛沙姆或乳糖中的一种或多种。
[0010] 所述两嵌段两亲性聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-径基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二 醇共聚物中的一种或多种，分子量为5，OOO~80，OOO道尔顿；
[0011] 神经生长因子是W二聚体形式起药效，因此二聚体的解聚降低了药物的活性。本 发明研究发现冻干保护剂能够单独或与稳定剂协同保护NGF二聚体，抵抗其在冻干过程中 受到的应力作用(包括低溫应力，pH的改变，离子强度增加等），保护神经生长因子在冻干和 储存过程中的结构和活性。而且协同作用使得稳定剂在极低含量条件下，提高了神经生长 因子在释放过程中的稳定性。本发明中神经生长因子在冻干、储存和释放过程中二聚体形 式得到很好的保护，极大的提高药物的活性。
[0012] 本发明所用的两嵌段两亲性聚合物的种类及分子量的选择，综合考虑了聚合物的 降解率、物理性质、神经生长因子的释放周期等多种因素。
[0013] 优选的神经生长因子缓释微球制剂，由W下重量百分比含量的成份组成：
[0014] 神经生长因子0.01~1.26%，两嵌段两亲性聚合物70.00~99.00%，稳定剂0.005 ~3.14%，冻干保护剂0.23~42.73% ;两嵌段两亲性聚合物的分子量为10，000~40，000道 尔顿。
[0015] 所述聚乳酸-径基乙酸共聚物中聚乳酸和径基乙酸的比例为50:50~85:15,聚乳 酸-聚乙二醇共聚物中，聚乳酸和聚乙二醇的比例为5:1~20:1。
[0016] 所述稳定剂聚乙二醇为聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000、 聚乙二醇2000或聚乙二醇4000。
[0017] 更优选的神经生长因子缓释微球制剂，由W下重量百分比含量的成份组成：
[001引神经生长因子0.02~1.26%，两嵌段两亲性聚合物90.00~98.00%，稳定剂0.015 ~3.14%，冻干保护剂1.21~9.05%。
[0019] 本发明所述神经生长因子包括但不限于鼠源性神经生长因子(mNGF)、人源性神经 生长因子化NG巧或重组人神经生长因子(riiNG巧。
[0020] 所述神经生长因子缓释微球制剂的平均粒径为1~100微米，优选20~80微米。
[0021] 神经生长因子缓释微球制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0022] 1)将含神经生长因子和稳定剂的水相作为内水相Wi,将两嵌段两亲性聚合物材料 溶于有机溶剂中，形成油相0;将运两相混合均质乳化制备Wi/0初乳液；
[0023] 2)将步骤1)所得Wi/0初乳液加入到含有表面活性剂的外水相化中，再用一定的转 速均质体系形成Wi/0/恥复乳液；
[0024] 3)将步骤2)所得W1/0/W2复乳液通过室溫揽拌挥发或将其倒入含有化Cl的萃取液 去除有机溶剂，再将微球离屯、、洗涂；
[0025] 4)将步骤3)所得的微球悬浮于含有冻干保护剂的水溶液中，经过冷冻干燥后，得 到神经生长因子缓释微球制剂。
[0026] 所述步骤1)中的内水相选自去离子水、巧樣酸缓冲液、醋酸缓冲液、憐酸缓冲液中 的一种，有机溶剂选自二氯甲烧、=氯甲烧、二甲苯、甲苯、乙酸乙醋、丙酬中的任意一种或 至少巧巾的混合物，有机溶剂中含有的两嵌段两亲性聚合物的浓度为0.010~0.500g/ml，两 嵌段两亲性聚合物与神经生长因子的重量含量比为4500: 1~50: 1，稳定剂浓度为0~ 0.200g/ml，内水相Wi与油相0的体积比为1:1~1:15;步骤2)中的表面活性剂选自聚乙締醇 (PVA)、聚山梨醋(Tween 80)、聚山梨醋(Tween 20)、或十二烷基横酸钢(SDS)，表面活性剂 浓度为0.0 Ol~0. lOOg/ml，油相0与外水相化的体积比1:2~1:25;步骤4)中冻干保护剂浓 度为 0.001 ~0.150g/ml。
[0027] 优选的，所述步骤I)中有机溶剂中含有的两嵌段两亲性聚合物的浓度0.050~ 0.300g/ml，聚合物与NGF重量含量比为4500:1~50:1，稳定剂浓度为0.0005~0.050g/ml， 所述内水相Wi和油相0的体积比为1:2~1:10;步骤2)中表面活性剂的浓度为0.002~ 0.050g/ml，油相0与外水相W2的体积比1: 5~1: 20 ;步骤4)中冻干保护剂浓度为0.005~ 0.030g/ml〇
[0028] 对本发明产品进行包埋率、载药量、二聚体含量、NG巧舌性测定的方法如下：
[0029] 1、包埋率，按照W下方式计算：
[0030] 包埋率（％)=微球中药物的测得载药量/微球中药物的理论载药量(iig/mg)X 100%;
[0031] 2、载药量=[微球中药物量/(微球中药物量+聚合物量)]X 100%。
[0032] 3、二聚体含量，采用SEC-HPLC方法检测，色谱柱选用TSK G3000SWXL，流动相为含 有15%乙腊的憐酸盐缓冲液，流速为0.6ml/min，并按W下公式计算：
[0033] 二聚体含量（％ )=二聚体峰面积/所有峰面积总和。
[0034] 4、NGF活性，采用细胞法测定，测定方法如下：（具体见CN103376248A中所述方法）
[0035] 选择表达NGF高亲和力受体化kA的TF-I细胞，利用NGF能够剂量依赖性地促进TF-I 细胞增殖的特点，在一定范围内，用一系列浓度的NGF溶液作用TF-I细胞，一段时间后用MTT 法测定TF-I细胞增殖情况。对NGF浓度和其对应的细胞增殖情况测定值进行四参数拟合，确 定NGF对TF-I细胞增殖作用为最大值一半时的稀释倍数。然后根据供试品和标准品的稀释 倍数W及标准品的活性值计算得到供试品的活性值。
[0036] 本发明具有如下有益效果：
[0037] 1、本发明针对神经生长因子缓释微球中蛋白药物活性易受影响的缺陷，采用冻干 保护剂单独或与稳定剂协同作用，保持冻干、储存和释放过程中神经生长因子的二聚体形 式，并进一步增强神经生长因子在冻干、储存和释放过程中的稳定性。本发明使蛋白二聚体 含量在冻干、储存12个月后一直维持在99% W上;释放完全后，二聚体含量维持在90% W 上，活性保持在80 % W上。
[0038] 2、本发明显著降低了稳定剂的含量，避免稳定剂过多对药物释放产生的不利影 响，降低了突释，使释放更稳定，特别在释放后期极大提高了药物的活性:微球包埋率高于 85% ;24小时突释率低于13%，在相应释放周期内，释放稳定。同时在冻干和释放过程中，药 物的二聚体形式得W维持，极大保持了药物的活性。
[0039] 下面结合实施例对本发明做进一步描述，但本发明不限制于实施例中，凡依照本 发明公开内容所做的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0040] 图1为实施例1制备的神经生长因子缓释微