可来源于血小板浓缩液的生物活性组合物及其制备和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明一般涉及来源于动物血小板产品的生物活性物质及其制备和使用方法的领域。
【背景技术】
[0002]用于治疗处理的细胞或含有细胞的组合物的施用正在成为日益流行的治疗方式。这样的治疗可以包括，例如，施用具有分化成包括例如骨、脂肪、软骨和肌肉的间叶细胞谱系细胞的潜能的间充质干细胞(MSC)。
[0003]为了获得治疗量的用于移植的细胞，经常需要从原始群体扩增细胞群体。用于扩增细胞群体的培养基为细胞代谢、生长和增殖提供必需营养物。经常使用胎牛血清(FBS)作为促进群体扩增的补充剂。因为FBS的低含量抗体，因为FBS包含刺激细胞生长和增殖的许多生长因子以及因为FBS的制造相对便宜，所以FBS—直是优选的补充剂。然而，FBS具有公认的缺点，包括病原体的传播风险，如牛海绵状脑病。
[0004]人血小板裂解物(hPL)已作为FBS的潜在的、非异种替代品出现。hPL来源于已知含有多种生长因子的血小板。除了生长因子外，目前的hPL分离技术通常还产生保留了高浓度的纤维蛋白原(一种参与凝块形成的糖蛋白)的组合物。因为它们的纤维蛋白原含量和形成凝块的倾向，目前的商业hPL组合物经常与一种或多种抗凝添加剂，典型地肝素一起使用。hPL中的抗凝添加剂增加了 hPL生产和/或使用的成本，并且在肝素的生物活性是有害的情况下，可能会存在问题。此外，虽然已经提出了多种用于生产hPL的方法，但是实现hPL产品的目标组成分布或生物活性的尝试经常导致工艺复杂性和/或密集设备要求。作为FBS的替代品的hPL的广泛采用将需要经济上可行的方法，但是该方法产生所期望的且有效的组合物。
[0005]鉴于这样的背景，需要基本上不含纤维蛋白原，保留了对细胞增殖有益的生长因子并可以容易地且经济地制造的人血小板裂解物组合物。
【发明内容】
[0006]在本发明的某些方面，已经发现，从血源性血小板浓缩液(优选人)中可以独特地处理有利的血源性血小板浓缩液的生物活性级分。生物活性级分可以具有存在于起始浓缩液中的生长因子和/或其它物质的新的组成分布，并且处理方法可以涉及凝结和分离浓缩液级分的新技术和/或新的用来澄清来源于浓缩液的液体级分的深层过滤操作。
[0007]在一个方面，用于处理血小板裂解物组合物的方法包括如下步骤:裂解含有血小板和血浆的人血源性浓缩液的血小板以形成裂解的血小板制备物，通过将裂解的血小板制备物中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白形成凝块凝胶，以及压榨凝块凝胶以从凝块凝胶中压出液体。
[0008]在另一个方面，方法包括使血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分通过至少第一深层过滤器，以便从生物活性级分中除去悬浮固体，所述血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白，和TGF-βΙ、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1 α及VEGF中的至少一种，任选地全部，其中纤维蛋白原以低于20，000ng/mL的含量存在。血小板浓缩液优选是人血小板浓缩液。在优选的方式中，液体生物活性级分通过第一深层过滤器，还通过第二深层过滤器，其中第二深层过滤器任选具有比第一深层过滤器小的公称微米等级。
[0009]在另一个方面，提供了包含人血源性血小板浓缩液的生物活性级分的组合物，该血小板浓缩液含有人血小板和人血楽，该生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、TGF-β 1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1 α 和 VEGF。生物活性级分可具有以低于约20，000ng/mL的含量存在，例如在约500ng/mL至约20，000ng/mL范围内的纤维蛋白原，和/或生物活性级分或含有它的细胞培养基可以不含或基本上不含所添加的肝素(即，非原产于血小板浓缩液起始原料的肝素)。生物活性级分可以具有如本文所公开的生长因子含量或比例。在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括:
[00?0] 含量低于20，000]^/1111^液体生物活性级分，例如在约5001^/1]11^至约20，0001^/1]11^液体生物活性级分范围内的纤维蛋白原；
[0011]含量为至少2mg/dL液体生物活性级分的白蛋白；
[0012]含量为至少lg/dL液体生物活性级分的球蛋白；
[0013]含量为至少5000皮克/毫升(“pg/mL”)液体生物活性级分的TGF-βΙ;
[0014]含量为至少20pg/mL液体生物活性级分的EGF;
[0015]含量为至少5pg/mL液体生物活性级分的FGF-β;
[0016]含量为至少200pg/mL液体生物活性级分的PDGF-AA;
[0017]含量为至少50pg/mL液体生物活性级分的PDGF-BB;
[0018]含量为至少100pg/mL液体生物活性级分的SDF-Ια;和
[0019]含量为至少10pg/mL液体生物活性级分的VEGF。
[0020]本公开还提供了用于制备生物活性组合物的方法，包括如下步骤:将凝结剂添加到血小板裂解物组合物中以形成凝结物质，将凝结物质中的凝结固体与液体分离，以及使液体经受深层无菌过滤。在一些形式中，该方法还包括将生物活性组合物包装于无菌容器中。
[0021 ]在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括:
[0022]含量在约 200pg/mL 至约 350pg/mL 之间的 FGF-2;
[0023 ]含量在约 1800pg/mL 至约 3100pg/mL 之间的 EGF ；
[0024]含量在约24，000pg/mL 至约 28，000pg/mL 之间的 PDGF-AA ；
[0025]含量在约50ng/mL 至约 80ng/mL 之间的 PDGF-BB ；
[0026]含量在约500pg/mL至约800pg/mL之间的VEGF;
[0027]含量在约60ng/mL至约90ng/mL之间的TGF_b ；和
[0028]含量低于2.5yg/mL的纤维蛋白原。
[0029]本文公开的另外的实施方案涉及本文所描述的生物活性级分或组合物用于细胞培养、冷冻保存或治疗目的的用途。
[0030]通过本文的说明，对本技术领域的普通技术人员来说，更进一步的实施方案以及特征和优点将是显而易见的。
【附图说明】
[0031]图1示出了用于制备人血小板浓缩液组合物的液体生物活性级分的方法。
[0032]图2是无菌包装中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。
[0033]图3是滴瓶中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。
【具体实施方式】
[0034]为了有助于对本发明的原理的理解的目的，现在将参照某些实施方案并且使用特定的语言来描述它们。然而应当理解的是，无意因此限制本发明的范围。所描述的实施方案中的任何变化和进一步的修改，以及如本文中所描述的本发明的原理的任何进一步的应用都视为本发明所涉及的领域的技术人员通常会想到的。
[0035]—般来讲，本公开提供了生物活性组合物和制备生物活性组合物的方法，该生物活性组合物可用作，例如，细胞培养补充剂和/或治疗剂。本公开的组合物包括来源于人源的组合物，从而克服了与异种组合物如FBS相关的问题。此外，本发明优选的组合物，虽然保留了重要的生长因子和其它化学物质，但是具有低含量的纤维蛋白原，且不需要添加在使用过程中防止有问题的凝结发生的抗凝剂如肝素。
[0036]现在转向图1，所示是用于制备来自血小板浓缩液组合物的生物活性级分的一个示例性方法100 ο该方法包括以下步骤:获得血小板浓缩液OI，将血小板浓缩液冷冻02，将血小板浓缩液解冻03，向血小板浓缩液添加凝结剂04，将凝块固体与液体分离05，用第一深层过滤器过滤液体06，用第二深层过滤器过滤液体07，用无菌过滤器过滤液体08，以及包装液体09。在某些方面，如下讨论详细叙述了对每一个所描述的一般步骤的选择;然而，应该理解的是，对于本文中的所有实施例，并非都需要所有所描述的一般步骤，并且将包括对应于一个、一些或所有所描述的步骤的特征的新方法视为本文的实施方案。
[0037]可以以任何合适的方式获得用作所公开方法的源材料的血小板浓缩液组合物和生物活性级分。如本文所使用的，术语血小板浓缩液是指含有已经从血源中浓缩的血小板的液体组合物。血源优选是人血，如全人外周血。血小板浓缩液优选包含血小板和血浆蛋白两者，并且可以由血小板单位来提供，该血小板单位通过机采从人供体的全外周血获得。可以预期来自其它物种例如哺乳动物物种的全血也可以用作待进行如本文所描述的处理的血小板浓缩液的来源。在某些实施方案中，在处理过程中的某一时刻，可以将来自不同的人或其它供体的血小板单位汇集以获得生物活性级分。在如今的典型实践中，每个人供体机采的血小板单位具有约100至约500mL，更典型地约100至400mL的体积，并且含有约100至500 X 19个血小板和机采过程中与血小板分离的血浆。捐献的人机采血小板单位具有供在医疗卫生机构使用的相对短的保质期，一般为约五天。在本文的方法中所使用的血小板单位可以是从医疗卫生机构获得的、最近到期的人机采血小板单位，并且在用来制备如本文所描述的生物活性级分之前，可以任选地在任何合适的温度例如约_20°C冷冻储存。
[0038]在制备生物活性级分中，可以通过合适的方法释放血小板内容物。在某些方式中，通过使血小板经过至少一个用来释放血小板内容物的冻融循环，且任选地多个冻融循环(例如，2个或3个冻融循环)而使血小板裂解。在使用冻融循环中，血小板浓缩液可在任何合适的温度下进行冷冻。在一些方面，在约-10°C至约_80°C之间的温度下冷冻血小板浓缩液。在具体的优选实施方案中，在约-20 0C下冷冻血小板浓缩液。为了裂解血小板，例如在37°C的水浴中或通过其它有效的手段，使冷冻的血小板浓缩液解冻，从而形成“原始”血小板裂解物组合物。原始血小板裂解物包含裂解的血小板膜和生长因子以及从裂解的血小板中释放的其它物质。当被解冻的血小板浓缩液包含血浆和血小板时，血小板裂解物还将含有血浆，包括其中的血浆蛋白。在本文的某些方面，可以使用用于释放血小板内容物的其它技术，例如用凝血酶激活。然而，据认为用于裂解血小板的冻融或其它机械技术的优点在于它们不需要将非天然蛋白(如凝血酶)添加到血小板浓缩液中，该添加既会增加成本又使得在下游所处理的材料中存在至少一些凝血酶。
[0039]原始血小板裂解物含有多种来自血小板浓缩液起始材料的生长因子。这些生长因子可以包括，例如，转化生长因子W、表皮生长因子、碱性成纤维