含佐剂疫苗制剂的利记博彩app
【专利说明】含佐剂疫苗制剂
[0001 ]本申请是申请日为2010年10月I日的题为“含佐剂疫苗制剂”的中国专利申请号201080055048.2的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及含佐剂疫苗(adjuvantedvaccine)制剂，尤其是能够增强粘膜免疫应答的流感疫苗，例如在鼻内或肌内递送后。
【背景技术】
[0003]季节性流感仍然是全世界死亡率和发病率的主要原因之一。每年进行疫苗接种是预防和控制流感感染的最有效对策。季节性流感疫苗是基于对下一季节流行病的预期株的预测而制备的。也有一些不预防感染本身的肠胃外注射的疫苗，其能够减少感染后的严重性和复杂性。肠胃外的疫苗能够诱导在血清中中和IgG抗体，但是它们不能诱导在粘膜的表面起作用的分泌型IgA抗体。相比之下，鼻内(1.η.)疫苗可诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。在粘膜的膜表面上的分泌型IgA抗体对于预防感染是十分有效的，因为它们在病原体附着到上皮细胞表面(其是流感病毒感染的第一个靶点)之前在粘膜的膜表面上起作用。此夕卜，血清IgG抗体针对漂移病毒株(drifted viral strain)不是那么有效，因为它们与分泌型IgA抗体相比具有更高的特异性。分泌型IgA抗体针对流感病毒的变异株具有交叉保护的作用。IgA的交叉反应作用的精确机制仍然是未知的，但是该现象在预防感染中是很大的优势。流感显示出改变其两种主要膜蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性的非凡能力。这通过在远离于人类人群中建立的适应性免疫应答的连续选择而发生。由于该病毒的高突变率，特定的疫苗制剂通常只在约一年内有作用。世界卫生组织每年整理疫苗的目录，以包括最有可能在第二年发起攻击的病毒株。现今，常规疫苗是由三种灭活的流感病毒(两种A-株和一种B株)所构成的疫苗。每年基于由WHO预期会在即将到来的流感季节中流行的流感株而重新配制这种三价流感疫苗。例如，在2007-2008年，该每年更新的三价流感疫苗由来自流感H3N2、HlNl和B流感病毒的血凝素(HA)表面糖蛋白组分组成。
[0004]疫苗1.η.递送的其他优势在于，疫苗的递送不需要受过训练的卫生保健人员来进行疫苗的给药，这使得这种类型的疫苗适于患有针恐怖症(needle-phobia)的人群并且防止针刺损伤问题的发生。而且，有报道称粘膜免疫系统在生命中发育较早且不受老化的影响(McElhaney JE.Vaccine 2005 Jul 8；23 Suppl 1:S10-25；Szewczuk MR et al.Ann NY Acad Sci 1983 Jun 30 ;409:333-44)。因此，例如鼻内流感免疫的伴生优势在于，它能够在所有年龄段中潜在提供有效免疫，并且能够用于大规模疫苗接种。人们已经对经由鼻或口咽途径对抗流感以及利用灭活流感抗原的免疫法的各种概念进行了研究以作为对于皮下或肌肉注射免疫的更少使用针的其他选择方案。对于支持更少地使用针的方法的试验数据已经在动物模型中产生。由动物数据支持的利用灭活的流感抗原(如化学灭活整个病毒粒子，或进一步处理的病毒组分如裂解病毒，或纯化的表面抗原血细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)处理)经鼻内途径用于免疫的构思包括与灭活的流感抗原联合使用佐剂或免疫刺激物，或需要多疫苗接种。佐剂是增强与其混合的抗原的免疫原性的任何物质。在人类中，经由鼻内途径抗流感的成功疫苗接种仅报道了(a)活(冷适应株)流感疫苗(FluMist?，Medlmmune Vaccines Inc)、(b)用大肠杆菌(E.coli)的不耐热毒素(heat labile toxin)作为佐剂的类病毒体(virosomal)流感疫苗(NasalFlu，Berna B1tech Ltd)或(c)利用大量抗原病且重复接种。虽然活疫苗能够诱导令人满意的免疫反应，但它们作为活病毒的特定性质会引起另外的安全考虑，并且可能会由于要求在上呼吸道附近发生病毒复制而诱导副作用。此外，其所要求的存储条件正在限制这些产品的商品化。大肠杆菌HLT作为佐剂的鼻内流感疫苗的使用与面瘫(贝尔麻痹)之间的密切联系导致HLT作为佐剂的类病毒体疫苗退出市场。
[0005]目前，活的减弱的流感病毒疫苗(LAIV)已上市以用于1.η.给药。LAIV疫苗已经显示出既诱导全身免疫反应又诱导粘膜免疫反应。然而，FDA批准LAIV疫苗仅用于年龄为2-49岁的人，而不能用于高危人群(老年人、儿童以及长期患病的患者)(美国国家疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Pre vent 1n) http: //www.cdc.gov/flu/profess1nals/vaccinat1n/pdf/targetpopchart.pdf；BeIshe RB et al.Vaccine 2008Sep 12；26 Suppl 4:D10_6)。然而，大部分上市销售的流感疫苗是灭活疫苗，其可安全地经由1.η.途径给予全部人群。这些疫苗的缺点是，它们在经由该途径给药时较表现出弱的免疫原性(Vaccine 2007 Jul 20 ； 25(29): 5367-73 ；Eyles et al.,B1Drugs 2000 Jan ； 13
(I):35-59) ο
[0006]为了增加免疫原性，灭活流感疫苗需要佐剂以在经由1.η.途径给药时加强免疫反应。目前用于1.η.免疫法的若干佐剂正在开发之中，如病毒样颗粒(Matassov D etal.Viral Immunol 2007 Sep;20(3):441-52)、ISC0MS(Sjolander S et al.Vaccine 2001Jul 16; 19(28-29):4072-80)、脂类、核酸类(Jos 印 h et al.Vaccine 2006 May 1；24(18):3990-4006)、以及细菌组分(Haan et al.Vaccine 2001 Apr 6 ； 19(20-22): 2898-907 ；Plante et al.Vaccine 2001 Oct 12; 20(1-2): 218-25)。然而，许多佐剂系统的发展受到安全性和管理问题的妨碍。例如，有效的细菌佐剂如LT(大肠杆菌的不耐热毒素)已在人类中表现出严重的副作用(Mutsch et al.N Engl J Med 2004 Feb 26; 350(9): 896-903)。已建议用于流感疫苗的含铝盐佐剂在生产时不仅需要额外的混合步骤从而减慢总体生产，而且包含这些盐还与各种问题相关。例如，它们的不溶性意味着吸附的抗原从混悬剂中沉降，因此从大量疫苗制备单个剂量时就需要加倍小心。此外，抗原与盐结合使最终的疫苗质量控制变得更为复杂。尤其是，对流感疫苗的一些效能测试基于需要非结合抗原的体外免疫测定，即吸附至佐剂意味着不能使用这些测试。
[0007]最近，更多地关注于免疫应答的表型即Thl、Th2或均衡应答。经由1.η.途径给予的亚单位疫苗以及许多鼻佐剂如壳聚糖、ISC0MS、脂类以及LT诱导混合的Thl/Th2型应答。然而，认为Thl应答要优于Th2或混合应答，因为它I)导致更好保护而免受感染;且2)通过分泌INF-γ而有助于病毒中和作用。此外，自然感染也诱导Thl型应答。另外，在粘膜膜表面上的分泌型IgA抗体对于预防感染是十分有效的，重要的是，分泌型IgA抗体对流感病毒的变异株具有交叉保护的作用，而且该粘膜免疫系统在生命中发育较早且不受年龄增加的影响。
【发明内容】
[0008]因此，对于对人类有效、安全且易于被管理机构批准的佐剂有明确的需求。优选地，能够诱导粘膜免疫应答如分泌型IgA抗体和/或偏向Thl型免疫的应答的疫苗是合乎需要的。因此本发明的目的在于提供另外的且改进的含佐剂流感疫苗(用于大范围流行和大范围流行之间)，优选适合于鼻内和/或肌内给药的疫苗。另一个目标在于提供用于便于制造且符合成本低廉的每年再配制的流感疫苗的灵活方法。
[0009]人们发现，以上目标可以通过将抗原与获自革兰氏阳性细菌的灭活的肽聚糖颗粒共配制而得到满足。该颗粒不仅高效增强鼻内给予亚单位疫苗的免疫原性，而且还诱导分泌型IgA并将应答从均衡免疫应答调整到偏向Thl的免疫应答。与仅用亚单位流感病毒的常规肌内免疫相比，鼻内递送诱导与其相当的全身性免疫以及甚至超级的粘膜和细胞介导的免疫。可以通过简单混合抗原和细菌颗粒实现保护效应。
[0010]因此，本发明涉及含佐剂疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的保护性抗原或其抗原片段，例如病毒、细菌、寄生或酵母来源。
[0011]在一种实施方式中，抗原是病毒抗原，如乙型肝炎表面抗原或流感病毒抗原。
[0012]在另外的实施方式中，该制剂包含细菌抗原，优选至少两种细菌蛋白质抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的两种或多种蛋白质抗原或其抗原片段的保护性组合，如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原 PpmA、Sir A、IgAl蛋白酶、PspA、CbpA、PdBD或其它的组合，或鼠疫耶尔森氏菌属(Yersinia pestis)抗原LcrV、Fl、FliC的组合，或III型分泌途径抗原如LcrV、IpaB和D、SipB和D、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia 61^61"0(301;[1:;^3)、志贺菌属(311丨86113))的￥(^0的组合，或肠毒素大肠杆菌(enterotoxic Escherichia coli，ETEC)的LT和ST抗原的组合或其他细菌蛋白质抗原的组合。一方面，本发明提供包含PspA、CbpA和/或PdBD的保护性制剂。特别令人感兴趣的是本发明的肺炎球菌三价疫苗制剂，其中细菌蛋白质抗原是PspA、CbpA和PdBD。在与获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒混合后，发现该3种抗原的混合剂在感染肺炎链球菌的鼻内激发小鼠模型中提供了很好的保护。出人意料的是，在混合之后的保护活性比在抗原经由融合结合于蛋白质肽聚糖结合部分时更高(参见本文中下文的实施例12和图16)。并且，抗原的特定组合表现出对于保护活性的关联性，因为在与结合的抗原相比，与混合肽聚糖颗粒时包含抗原PpmA、IgAl蛋白酶、PspA、CbpA和PsaA的五价制剂是相对低的。参见实施例13和图17。
[0013]在另外的实施方式中，该制剂包含至少一种寄生抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的保护性寄生抗原或其抗原片段，如恶性疱原虫(Plasmodium falciparum)的环子孢子表面抗原或裂殖子表面抗原。示例性的保护性真菌抗原包括球孢菌属(Coccid1ides ssp)的抗原。适合的酵母抗原是假丝酵母(Candida ssp)的抗原。还提供了含佐剂疫苗制剂，包含获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒和至少一种多糖抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的保护性多糖抗原或其抗原片段，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、金色葡萄球菌荚膜多糖或其他多糖。
[0014]在一种优选的实施方式中，本发明提供了含佐剂流感疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种流感病毒抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。在另外的实施方式中，本发明提供了含佐剂乙型肝炎疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和
(ii)至少一种乙型肝炎病毒抗原(例如病毒的包膜蛋白，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg))或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。在另外的实施方式中，本发明提供了含佐剂肺炎球菌疫苗制剂，包括(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种肺炎球菌抗原，优选PdBD，更优选PspA、CbpA和PdBD，其抗原不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。
[0015]可以通过本领域已知的方法获得用于根据本发明的疫苗肽聚糖微粒。参见例如TO02/101026以及US 6，896，887，公开一种用于获得革兰氏阳性细菌的细胞壁物质的方法，包括用能够去除细胞壁组分(如来自所述细胞壁物质的蛋白质、(脂)磷壁酸((I i Po) t e i cho i cacid)或碳水化合物)的溶液处理所述细胞壁物质，其中所述细胞壁物质