玫瑰花多糖在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，提供一种玫瑰花多糖的新应用，具体涉及玫瑰花多糖 在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 20-30%的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后导致RAS蛋白过度激活造成的。而 且，这类肿瘤为常常伴随着对标准治疗方案响应差的难治性肿瘤(Pao et al.，2005)。因 此，Ras已成为公认的筛选抗癌药物靶点(刘雪梅等，2008)。
[0003] Ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS 蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起 线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀 丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤 模型广泛应用于筛选抑制Ras通路过度激活的抗肿瘤药物（Hara and Han，1995;王昉， 2005;Reineret al.，2008;刘雪梅等，2008)。本发明采用秀丽隐杆线虫作为评估工具，进行 下调Ras/MAPK信号通路过度激活抗肿瘤药物候选物的筛选。
[0004] 多糖具有抗肿瘤活性，但由于多糖的结构复杂，且其分子量、构型、电荷特性和取 代基的位置等均影响着多糖的抗肿瘤活性(Ma et al.，2013)，筛选抗肿瘤活性更好的多 糖，一直是这一领域研究的热点。玫瑰粗多糖具有抗肿瘤作用，300mg/Kg/d给药10天，对 S180荷瘤小鼠实体瘤的抑制率可达61.27 % (白伟芳，2010)。该文中报道玫瑰粗多糖是通过 抗氧化和提升脾脏指数，进而提高免疫力抗肿瘤。现有技术的缺陷在于仅公开了玫瑰花多 糖通过非特异性的抗氧化作用，或者提升机体免疫力辅助抗肿瘤。但是，玫瑰花多糖对于 Ras/MAPK通路过度激活导致的难治性肿瘤是否有效，尚未可知。
[0005] 基于上述研究现状，本发明现提供一种玫瑰花多糖的新应用，具体涉及玫瑰花多 糖在制备抗肿瘤药物中的应用。所述玫瑰花多糖对原癌基因 Ras/MAPK通路的过度激活具有 显著的下调作用，对由原癌基因 Ras/MAPK通路过度激活导致的肿瘤具有显著的治疗作用， 且毒性低，无致畸作用。提示玫瑰花多糖具有抗肿瘤的潜力，可在制备抗肿瘤药物中应用。 [0006] 参考文献
[0007] Clark,S.G.,X.Lu,et al.(1994).The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway,encodes two different proteins.Genetics 137:987-997.
[0008] Ferguson ,E.L. and H.R.Horvitz(1989).The multivulva phenotype of certain Caenorhabditis elegans mutants results from defects in two functionally redundant pathways.Genetics 123:109-121.
[0009] Hara,M.and M.Han(1995) .Ras famesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.Proceedings of the National Academy of Sciences 92:3333.
[0010] Huang,L.S.,P.Tzou,et al.(1994).The lin-151ocus encodes two negative regulators of Caenorhabditis elegans vulval development.Molecular biology of the cell 5(4):395.
[0011] Reiner,D.J. ,V.Gonzalez
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[0012] Pao,ff.et al.(2005).KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib.PLoS Med.2,el7.
[0013] Ma，L.，Qin，C.，Wang，M.，Gan，D.，Cao，L.，Ye，H.，et al.(2013).Preparation， preliminarycharacterization and inhibitory effect on human colon cancer HT-29cells of anacidic polysaccharide fraction from Stachys floridana Schuttl.ex Benth.Food andChemical Toxicology 60:269-276.
[0014] 白伟芳.玫瑰花多糖的提取及其功效研究.山东轻工业学院，2010.
[0015]刘雪梅，邓平，等.（2008).基于Ras信号转导途径的药物靶标研究进展.药学进展 32(11):481-487.
[0016]王昉(2005).利用线虫作为模式生物筛选能够抑制癌基因 ras活性的药物.复旦大 学博士后出站报告.
[0017]姜琼，谢妤（2013).苯酚一硫酸法测定多糖方法的改进.江苏农业科学41(12): 316-318.
【发明内容】
[0018] 本发明的目的是提供一种玫瑰花多糖的新应用，具体涉及玫瑰花多糖在制备抗肿 瘤药物中的应用，以期提供一种抗肿瘤的药物候选物。
[0019] 其中，所述肿瘤是由原癌基因 Ras/MAPK通路过度激活导致的。
[0020] 所述玫瑰花多糖作为药效成分的药物制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口 服液、片剂等任一剂型，这是本领域技术人员可以理解的。
[0021 ]本发明所述玫瑰花多糖的制备方法如下：
[0022]水提醇沉法制备玫瑰花多糖：称取玫瑰花，按1: 20-30质量份数加蒸馏水，浸泡 20min，加热煮沸并保持30min，lOOOOrpm离心10min，取上清液，重复三次，合并上清液，加入 5倍体积的无水乙醇于室温沉淀12h，lOOOOrpm离心5min，收集沉淀，待溶剂挥干，收集固体， 得粗多糖；
[0023]粗多糖脱蛋白：将粗多糖加蒸馏水溶解后配置为100mg/ml的水溶液，加入1/5体积 5:1 v/v的氯仿:正丁醇，剧烈振荡，4000rpm离心20min，弃沉淀，重复多次直至离心后溶剂介 面无沉淀；
[0024]粗多糖脱色素:取脱蛋白后的粗多糖，加入10倍体积的65%的乙醇，55°C水浴提取 5h，4000rpm 离心 5min，弃上清；
[0025]粗多糖脱酚:取脱色素后的粗多糖，加入等体积的丙酮溶液，充分振摇，4000rpm离 心20min，收取沉淀，即得所述玫瑰花多糖。其中，所述丙酮为无水丙酮。
[0026]采用苯酚-浓硫酸法检测玫瑰花多糖含量，具体方法参见姜琼和谢妤(2013)，略改 动。简单地说，取所述玫瑰花多糖，用蒸馏水溶解成15mg/mL的玫瑰花多糖水溶液，100倍稀 释。之后按照样品、5%苯酚溶液、浓硫酸为2:1:5的比例添加试剂，混匀5min后，沸水浴加热 15min，冷却。处理好的待检样品在490nm处测量吸光度值。标准曲线采用葡萄糖为标准品绘 制，经检测，所述玫瑰花多糖中多糖含量为85.4%。
[0027]本发明的有益效果在于：
[0028] 1.玫瑰花多糖可以显著抑制原癌基因 Ras/MAPK通路过度激活，可在制备治疗由原 癌基因 Ras/MAPK通路过度激活引起的肿瘤的药物中应用。
[0029] 2.玫瑰花多糖仅仅作用于过度激活的突变体RAS蛋白，而对野生型RAS蛋白无影 响。提示玫瑰花多糖在应用上安全，它仅作用于癌细胞，而不会作用于正常细胞。
[0030] 3.玫瑰花多糖显著下调原癌基因 Ras/MAPK通路过度激活，并不是致突变引起的， 不致畸。以下提供具体实施例以实现本发明所述的技术方案，但本发明的保护范围不局限 于以下所述。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1玫瑰花多糖的制备
[0032] 称取玫瑰花，按1:20-30质量份数加蒸馏水，浸泡20min，加热煮沸并保持30min， lOOOOrpm离心10min，取上清液，重复三次，合并上清液，加入5倍体积的无水乙醇于室温沉 淀12h，lOOOOrpm离心5min，收集沉淀，待溶剂挥干，收集固体，得粗多糖；
[0033]粗多糖脱蛋白：将粗多糖加蒸馏水溶解后配置为100mg/ml的水溶液，加入1/5体积 5:1 v/v的氯仿:正丁醇，剧烈振荡，4000rpm离心20min，弃沉淀，重复多次直至离心后溶剂介 面无沉淀；
[0034]粗多糖脱色素:取脱蛋白后的粗多糖，加入10倍体积的65%的乙醇，55°C水浴提取 5h，4000rpm 离心 5min，弃上清；
[0035]粗多糖脱酚:取脱色素后的粗多糖，加入等体积的丙酮溶液，充分振摇，4000rpm离 心20min，收取沉淀，即得所述玫瑰花多糖，经检测，所述玫瑰花多糖中多糖含量为85.4%。 [0036]实施例2玫瑰花多糖对秀丽隐杆线虫MT2124(let-60突变)的作用 [0037] 1、生物材料：
[0038] (1)秀刚隐杆线虫MT2124,基因型：let_60(nl046sd，gf) IV，购自 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。
[0039] MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，该株系线虫为多阴门表型，相当 于罹患了人类Ras突变的难治性肿瘤。采用受试药物处理秀丽隐杆线虫MT2124,如果受试药 物能够抑制受试线虫多阴门表型的产生，促使它们发育成为野生型，则说明药物作用于ras 通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤活性。野生型线虫在受试线虫群体中所占的比 例越高，表明受试药物作用效果越好。
[0040] (2)大肠杆菌0P50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
[0041] 2、试剂
[0042] S液培养基：1 升S基础液，10ml 1M柠檬酸钾，10ml Trace，3ml 1M CaC12,3ml 1M MgS04, lml胆固醇（5mg/ml)。
[0043] S基础液：5.85g NaCl，lg K2HP〇4,6g KH2P〇4,加水至 1 升，121°C灭菌20min备用。
[0044] 1M柠檬酸钾:20g柠檬酸，293.5g柠檬酸三钾，加水至1升，121°C灭菌20min。
[0045] ΤΓΒ〇θ^?7ψ^：1.86δΕ0ΤΑ,0.69δΡθ804.7Η20,0. 2gMnCl 2 . 4Η2 0 , 0 · 025gCuS04 · 5Η20，0 · 29ZnS04 · 7Η20，加水至1升，121°C 灭菌 20min。
[0046] 1M CaC12:55.5g CaC12溶于 1 升水中，121°C灭菌20min。
[0047] lMMgS04:246.47g MgS04.7H20溶于 1 升水中，121°C灭菌20min。
[0048] M9缓冲液：NaCl 1.98g，Na2HP04 2.38g，KH2P04 1.20g，MgS04 0.048g，蒸馏水 400mL〇
[0049]