非糖基化溶葡球菌素变体蛋白的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本申请要求2013年8月6日提交的美国临时专利申请系列号61/862,599的优先权， 所述临时申请的内容整体通过参考以其全文并入本文。
[0002] 本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助 号为1R21 AI098122的政府支持下做出的。美国政府在本发明中具有一定权利。
【背景技术】
[0003] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一种重要的细菌病原体，其引起多 种可能危及生命的感染，包括皮肤病损（Pantosti，A ?和 M.Venditti .2009.Eu;r.Respi;r.J.34: 1190-1196)、肺部感染（Defres 等， 2009.Eur.Respir.J.34: 1470-1476)、菌血症（Wisplinghoff 等， 2004 ? Clin ? Infect ? Dis ? 39:309-317)和心内膜炎（Fowler等，2005 ? JAMA 293:3012-3021) 〇 尽管医学共同体努力尝试更有效地对抗这种病原体，但在最近几十年中医院和社区获得性 金黄色葡萄球菌（S.aureus)感染的病例仍不断增加（Hospital Infections Program. 1999 .Am. J. Infect .Control 27:520-532)，并且临床分离株中抗生素耐药性的发 生率也稳步增长（Taubes，G. 2008Science 321: 356-361)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA)的出现和快速传播深深地困扰着公共卫生官员和健康护 理提供者，这类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌目前占医院和某些社区背景中金黄色葡萄球菌 (S.aureus)分离株的50% 以上（Grundmann等，2006 .Lancet 368:874-885)。此外，已知MRSA 获得另外的耐药性元件，由此产生危险的多药耐药菌株。特别引人担忧的是对被广泛当作 MRSA感染的"终极治疗药物"（drug of last resort)的万古霉素表现出降低的敏感性的 MRSA分离株(Taubes，G.2008Science 321:356-361)。总的来说，这些数据强调了对开发通 过与常规抗细菌化学疗法不同的机理起作用的新的抗葡萄球菌药剂的迫切需求（Lowy， F?D?2007?Nat?Med?13:1418-1420)。
[0004] 溶葡球菌素(LST)是一种锌依赖性的甘氨酰甘氨酸内肽酶，其最初被编码在金黄 色葡萄球菌(S.aureus)的一种环境竞争者--模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans) 的pACKl质粒上(Gargis等，2010.Plasmid 64:104-109) 1ST酶选择性并高效地降解金黄色 葡萄球菌（S.aureus)细胞壁的肽聚糖组分中的五甘氨酸交联物，最终引起细菌裂解和死 亡。LST 发现于 1960 年代（Schindler，C.A ?和 V.T? Schuhardt ? 1964 .Proc ? Natl .Acad? Sci ? USA 51:104-109)，并且从那时起已经历了不 同研究组和组织的各种不同程度的临床前开发和甚至小规模的临床试验(Harrison等， 1975.Infect.Immun.11:309-312;Zygmunt，W.A?和P?A?Tavormina?1972?Prog?Drug Res ? 16: 309-333;Walsh等，2003 .Antimicrob .Agents Chemother ? 47: 554-558; Stark等， 1974.New Engl.J.Med.291:239-240;Martin，R.R?和A.White.1968.J.Lab.Clin.Med.71: 791-797)。关于LST作为治疗药剂的早期兴趣由于常规药物例如甲氧西林的容易获得而消 失，但由于广泛传播的抗生素耐药性和抗微生物剂开发管道的变窄，对LST生物医学应用的 热情被重新点燃（Szweda等，2012.Appl .Microbiol .Biotechnol .96:1157-1174) 〇
[0005] LST临床应用的一个障碍是根除某些感染所需的高剂量。在患有多药耐药葡萄球 菌肺炎、多发性脓肿和蜂窝组织炎的无反应性白血病患者中，LST似乎表现出良好效能 (Walsh等，2003 .Antimicrob ? Agents Chemother ? 47: 554-558)，但是这种效果需要酶的 500mg全身性推注。在另一项研究中，凝固酶阳性金黄色葡萄球菌(S. aureus)的鼻部携带者 显示出在鼻内LST治疗后，所述病原体被有效清除，但这种效果也需要大量酶(每天三次用 5mg/ml LST溶液进行鼻冲洗，共一周）（Mart in，R ? R ?和A ? Whi te ? 1968 ? J ? Lab ? Cl in ? Med ? 71: 791-797)。在鼻腔带菌清理的其他人类研究中，在类似的高剂量水平下获得了类似的结果 (Quickel等，1971 .Appl .Microbiol ? 22:446-450 ; Harr is等，1967 .Ant imicrob .Agents Chemother.7:110-112)。在与导管相关的金黄色葡萄球菌（S.aureus)生物膜的鼠类模型 中，在4天的治疗方案期间进行全身性LST给药以清除已建立的生物膜以及单次预防性给 药，防止了随后生物膜在留置导管上的形成（Kokai-Kun等， 2009. J.Antimicrob.Chemother. 64:94-100)。然而，将有效剂量外推到人类患者，将需要在 4天内给药超过16克酶。因此，尽管LST在动物模型和甚至人类研究中具有被证实的一致的 效能，但将有效剂量推广到大范围临床应用，将需要特别高效的生产平台。
[0006] 为达到这个目的，已在广泛的各种微生物表达宿主中生产LST。例如，溶葡球菌素 基因已在枯草芽孢杆菌（B.subtilis)细胞中表达（Zhdaova等， 2001 .Zh.Mikrobiol .Epidemiol. Tmmunobi 〇1 ? 4:3-6)。商品化LST的一个来源是天然生物体 模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的高细胞密度培养物，但来自于这个系统的工 业规模生产得率作为专有信息未被公开。可选地，来自于细菌宿主大肠杆菌(Escherichia coli)的表达得率已知在10至20mg/L的范围内（Sweda等，2001 ? Protein Expr ? Purif ? 22: 467-471 ;Szwe da 等，2005.J.Biotechnol ? 117 : 203-213; Sharma 等，2006.Protein Expr. Purif. 45: 206-215)，并且这种重组平台也是商业来源材料的重要贡献者。已使用乳 酸乳球菌(Lactococcus lactis)NICE系统进行用于临床试验的大规模LST生产(Mierau等， 2005.Microb.Cell Fact.4:15;Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:16)。在大体积高细 胞密度发酵中实现了 l〇〇mg/L的表达水平，但是最终的纯化得率仅为40mg/L(Mierau等， 2005 .Microb. Cel 1 Fact. 4:15)。随后对这种系统的过程优化将生物反应器表达水平提高 到300mg/L(Mierau等，2005 .Microb ? Cell Fact ? 4:16)，但仍存在相当大的进一步改进空 间。最后，应该注意到，L S T也已在哺乳动物细胞中表达（W i 1 1 i a m s 〇 n等， 1994. Appl.Environ.Microbiol. 60:771-776)，但没有尝试对得率进行最大化或甚至定量。
[0007] 几项专利和专利申请描述了在各种微生物表达系统中生产LST。例如，美国专利 如.4,931，390和￡?0299978公开了在大肠杆菌(￡.(：〇11)、枯草芽孢杆菌(8.8111^1118)和球 形芽孢杆菌（B.sphaericus)中表达克隆的LST基因。美国专利申请No. 2002/040924和W0 2003/082184公开了在大肠杆菌（E.coli)、乳酸乳球菌（L.lactis)和球形芽孢杆菌 (B.sphaericus)细胞中生产均质形式的重组LST蛋白。美国专利No.6,897,041、W0 2001/ 029201、EP1224271和KR1020020064886都公开了在大肠杆菌(E. coli)中表达重组LST的方 法。美国专利申请No. 2002/0006406公开了可以携带单一突变并且可以重组表达的LST的类 似物和变体。所述变体在球形芽孢杆菌(B.sphaericus)中生产，并且所述变体在野生型LST 的218位置处具有单一突变。美国专利申请No. 2005/0118159公开了具有增强的溶葡萄球菌 活性的截短的LST分子。所述生产在大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌(L.lactis)或球形芽孢 杆菌(B. sphaericus)中进行。美国专利申请No. 2008/0095756公开了LST变体和使用方法。 所述变体被描述为是"去免疫化"分子，意味着已从所述LST序列中去除T-细胞表位和结构 域。美国专利申请No. 2009/0186380公开了在大肠杆菌中表达LST的方法以及一系列突变体 LST 分子。最后，美国专利 No. 8，241，901、美国申请 No. 2007/009351 和 KR102008018960 公开 了在大肠杆菌中以高水平表达LST的方法。在这些专利和专利申请中公开的方法均未涉及 酵母中的LST表达。
[0008] LST代表了用于治疗葡萄球菌感染、尤其是MRSA菌株的感染的有希望的治疗药剂。 然而，正如上面讨论的，用于所述酶的常规表达系统受到各种限制，并且对于高效且成本效 益高的生产方法仍存在需求，以便于临床推广和非医学应用的开发。
[0009]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年中已被证明是高度成功的异源表达宿 主的酵母生物体(Cregg等，2