经翻译后修饰的有活性的可溶性神经调节蛋白同种型的利记博彩app
【专利说明】
[00011 本申请是申请号为200880121853.3的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及使用神经调节蛋白-1翻译后的各种修饰产物或剪切变体，尤其是可溶 于生理溶液的神经调节蛋白-1同种型作为药物，来治疗与认知有关的精神紊乱类疾病，如 精神分裂症、阿尔茨海默氏症以及帕金森氏症。
【背景技术】
[0003] 神经调节蛋白（NRG)为突触信号传递中的关键调节物质。这种跨膜蛋白由四种基 因编码(6-1、置6-2、置6-3和置6-4)，并通过选择性的1?嫩剪接和启动子使用以及尤其翻 译后修饰(如蛋白水解加工，其可自膜结合的全蛋白中释放可溶性的同种型)使其多样性进 一步提高。此外经证实还存在磷酸化与糖基化(Buonanno and Fischbach 2001)。它们的特 征在于不同的胞外结构域，且是ErbB受体酪氨酸激酶的配体，其涉及神经炎症以及基因转 录的下游(Holbro and Hynes 2004)。尤其是，NRG-I的可溶性同种型可由跨膜形式的NRG在 电刺激过程中经蛋白水解切割得到，并随后分泌为依赖于活性的突触调节物（Ozaki et al.2004)〇
[0004] 包含整个跨膜蛋白的N端胞外结构域(E⑶)的NRG-I的截短同种型(推测为β?)被证 实与学习和记忆相关联(Schillo et al.2005a;W003/014156)。对功能的研究证明，NRG-I 直接调节NMDA受体亚基组成(Ozaki et al. 1997 ;Eilam et al. 1998)。此外，这类NRG-1片 段由于抗凋亡作用而具有体内神经保护性质（Xu et al.2005A;Xu et al.2005B;Xu et al.2004)〇
[0005] 由于NMDA受体的NRG依赖性调节（Schrattenholz and Soskic2006)，以及随后的 下游事件（如兴奋性中毒、神经炎症以及凋亡）（在图1中总结），人们最近越发的认识到 NRG-I在人神经性疾病中扮演中心角色。有结果表明NRG-I在从肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨 海默氏症和帕金森氏症至中风以及精神分裂症的疾病中均发挥着重要作用（Britsch 2007)〇
[0006] NRG-I的这些重要的作用暗示其除了在神经保护以及在与认知相关的学习与记忆 中起到积极作用外，NRG-I还是各种特定脑区和细胞类型中的各种损伤后神经原组织再生 中的重要神经营养因子。很明显，它是维持及修复神经元回路的完整性的重要因子:神经保 护和功能丧失后的正确再生以及活性依赖型神经元可塑性的形成中的作用。
[0007] 在Kastin et al，2004证明调节蛋白1β可穿过血脑屏障后，对神经调节蛋白1β研 究的兴趣得到了进一步的点燃。其开辟了神经调节蛋白W的治疗应用的新途径。
[0008] 最近的研究证明了其在神经保护方面具有广泛的应用范围。两份出版物分别独立 的证明了神经调节蛋白1还是BACE(i3分泌酶、份定粉样蛋白转化酶）的底物，而这意味着神经 调节蛋白1与阿尔茨海默氏症相关联(Glabe 2006;Schubert 2006)。
[0009] 另外，在雪旺氏细胞中发现神经调节蛋白-1增加了 3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A 还原酶(雪旺氏细胞中胆固醇生物合成的限速酶）的转录(Pertusa et al .2007)。这对髓鞘 受影响的疾病（如神经分裂症和多发性硬化症)或涉及所谓的"富含胆固醇的脂後"的认知 相关功能有深远意义（Schrattenholz and Soskic 2006)。围绕轴突的雪旺氏细胞在生理 状态下表达NRGl受体ErbB2/ErbB3以及可溶性NRGla和NRG10。经去神经处理，成体的雪旺氏 细胞脱离与轴突的接触后，改变其形态学，停止表达NRG10，并上调NRGla及ErbB2/ErbB3的 表达（Geuna et al. 2007 ;Karoutzou et al. 2007) 〇
[0010]此外，遗传流行病学研究表明神经调节蛋白1与精神分裂症和阿尔茨海默氏症(尤 其与其精神病形式)有着明显的相关性(Farmer et al.，2007)。
[0011] 一些近期的遗传群体分析显示，特定NRG-I-SNP与阿尔茨海默氏症和精神分裂症 有关（Go et al.2005;Scolnick et al.2006;Ross et al.2006;Meeks et al.2006; Farmer et al.2007)。最近的这些发现与图I中其他含有功能的NRG的复合物的蛋白有关 (ErbB受体：（Benzel et al.2007;Thomson et al.2007;Hahn et al.2006)。还暗不了NRG-1在多发性硬化中的作用(Esper et al.2006)。
[0012] 有结果提不NRGl的危险等位基因与精神分裂症之间相关联的分子机制可能包括α 7亚类烟碱乙酰胆碱受体的下调(Mathew et al,2007)。
[0013] 根据本发明，发现重组的可溶性神经调节蛋白-1β同种型对精神分裂症、阿尔茨海 默氏症以及帕金森氏症的动物模型的学习和记忆状况可起到一定的药效。在静脉注射后， 神经调节蛋白_1β同种型在显著低于对照药物浓度的浓度有活性。
【发明内容】
[0014] 因此，本发明的第一方面为重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型用于制备治疗神 经性疾病(特别是与认知相关神经性疾病)的药物的用途。
[0015] 本发明的另一方面为药物组合物或试剂盒，其包含：（i)重组的可溶性神经调节蛋 白-1同种型、和(ii)其他的尤其是用于治疗神经性疾病(尤其是与认知相关的神经性疾病） 的药物。
[0016]此外，本发明另一方面为重组的可溶性神经调节蛋白-垌种型用于制备增强记忆 和认知的药物的用途。
[0017] 此外，本发明另一方面为治疗神经性疾病的方法，包括:给有需要的受试者施用药 学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型。
[0018] 此外，本发明另一方面为增强记忆和认知的方法，包括:给有需要的受试者施用药 学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型。
[0019] 此外，本发明另一方面为共施用重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型与其他药 物。
[0020] 据本发明可知，可溶性神经调节蛋白-1同种型已被证明对治疗神经性疾病(尤其 是疾病（如精神障碍(如精神分裂症、双相型障碍和抑郁型）、神经退行性疾病(如帕金森氏 症、阿尔茨海默氏症、多发性硬化(MS)、或肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癫痫)或神经性损伤(如 中风、创伤性脑损伤以及脊髓损伤）））有效。优选治疗精神分裂症，特别是精神分裂症的认 知相关方面、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症。另外，本发明还涉及重组的可溶性神经调节蛋 白-1同种型用于增强记忆和认知，特别是用于减少和/或抑制与神经性疾病（如阿尔茨海默 氏症和精神分裂症)相关的记忆和认知缺失的用途。
[0021] 所述重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型优选为人神经调节蛋白-1同种型，即包 含天然的人神经调节蛋白-1同种型的一级氨基酸序列或与重组同种型全长具有至少90% 的同一性，优选至少95%的同一性，及最优选至少98%的同一性的序列的重组同种型。
[0022] 本发明的可溶性重组神经调节蛋白-1同种型优选包含相应神经调节蛋白-1胞外 结构域的至少一部分(如人神经调节蛋白（如人神经调节蛋白_1β)胞外结构域的至少一部 分)。
[0023] 本发明的重组可溶性神经调节蛋白同种型的长度优选达250个氨基酸（如150~ 250个氨基酸）。例如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定的神经调节蛋白同种型的分 子量优选为约15KD~约35KD，尤其为约25KD~约32KD。重组的可溶性神经调节蛋白-1同种 型(尤其为重组的神经调节蛋白_1β同种型）的等电点(Pl)为约4~约9.5,优选为约4~约6。 该同种型可为由未修饰的氨基酸序列构成的未修饰多肽或经修饰多肽，其中所述修饰可选 自：磷酸化、糖基化、甲基化、十四酰化、氧化及它们的任意组合。在特别优选的实施方式中， 神经调节蛋白-1同种型包含至少一个磷酸化的氨基酸残基。另外，本发明包含缀合异源部 分，如聚(环氧烷烃)部分，特别是聚乙二醇部分。
[0024] 该重组的可溶性同种型可通过任何可有效递送到目标组织（如神经系统，特别是 中枢神经系统，如脑和/或脊髓)的途径施用。已发现，神经调节蛋白同种型的药学有效浓度 可通过全身给药达到。例如，该同种型可通过注射或输液(如静脉注射)施用。该同种型可 根据待治疗疾病的类型和严重程度，优选以0.1~5000ng/kg待治疗受试者体重的量，尤其 以2~1000ng/kg待治疗受试者体重的量，及更尤其以3~600ng/kg待治疗受试者体重的量 施用。在本发明的其他实施方式中，该可溶性同种型还可局部施用，如通过直接施用于中枢 神经系统（如脊髓和/或脑）。还可考虑通过腹膜内注射或皮下注射或吸入设备以达到500μ g/kg的更高剂量施用。待治疗的受试者优选为哺乳动物，更优选为人患者。
[0025] 该可溶性重组神经调节蛋白-1同种型可作为独立药物（即作为单一疗法)或组合 药物（即与其他药物(特别是其他适合于治疗神经性疾病的药物)组合)施用。尤其在治疗阿 尔茨海默氏症和帕金森氏症、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症或其他神经性疾病中的其他 药物的例子是:影响儿茶酚胺代谢的化合物、乙酰胆碱脂酶抑制剂，MAO-B-或COMT-抑制剂， 美金刚型通道阻断剂，多巴胺或5-羟色胺受体激动剂或拮抗剂，儿茶酚胺或5-羟色胺再摄 取抑制剂，以及任何类型的精神抑制药(如氯氮平、奥氯平或加巴喷丁类药物）。其他药物的 其他例是神经保护剂，例如PARP-I抑制剂，如W02006/008118和W02006/008119中所公开，所 述文献通过引用并入本文。
[0026] 因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的重组的可溶性神经调节蛋白-1同种 型与治疗精神障碍(如精神分裂症、双相型障碍及抑郁症)的药物(如奥氮平或氯氮平)的组 合。进一步实施方式涉及重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型与治疗神经退行性疾病（如 帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、MS或ALS)的药物的组合。再一实施方式涉及重组的可溶性神 经调节蛋白-1同种型与治疗神经性损伤（如中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤）的药物的组 合。
[0027] 可通过将重组的可溶性神经调节蛋白-1同种型与其他药物以药物组合物或试剂 盒的形式共施用来实现联合治疗，其中单个药物可分开施用或共同施用。
[0028] 神经调节蛋白-1同种型可为神经调节蛋白-II型、II型、III型、IV型、V型或VI型 同种型，优选为神经调节蛋白_1β同种型，神经调节蛋白-Ia同种型或感觉神经元和运动神 经元衍生因子(SMDF)同种型，特别是神经调节蛋白_1β同种型，更特别为人神经调节蛋白-1 β同种型。
[0029] 神经调节蛋白1β同种型具有穿过血脑屏障转运的活性。正如实施例中所显示的一 样，神经调节蛋白1?3经静脉注射/腹膜内注射后在脑中的优秀生物利用度为NRG 1β的治疗 应用铺平了道路。
[0030] 其抗凋亡、稳定髓鞘、抗炎症特性及与BACE的直接相互作用的组合为治疗中风、阿 尔茨海默氏症、MS和精神分裂症以及其他神经性疾病创造了机会。
[0031] 如上所述，本申请包括未经修饰的以及经修饰的神经调节蛋白-1同种型（特别是 神经调节蛋白_1β同种型）的用途。有证据表明，在神经调节蛋白_1(特别是其胞外结构域） 的特定氨基酸残基上发生翻译后修饰(像蛋白水解加工、磷酸化和糖基化）。尤其已报道了 神经调节蛋白-1可溶性片段的释放(Buonanno and Fischbach 2001;Fischbach 2007)。可 能的氧化也已被报道(Nadri et al.2007)。
[0032]本发明人证明优选的具有生理学活性的神经调节蛋白_1β同种型包含神经调节蛋 白-1邱勺胞外结构域或其已经翻译后修饰的一部分。该同种型优选被磷酸化修饰，其中1、2、 3个或者更多个氨基酸侧链残基(特别是如Tyr、Ser或Thr的有OH-基团的侧链残基)被磷酸 化修饰。优选的磷酸化位点位于79~82位氨基酸，133~136位氨基酸和/或158~161位氨基 酸(根据Falquet et al.，2002命名）。更优选的磷酸化位点位于12~14位氨基酸，30~32位 氨基酸和/或85~87位氨基酸。更潜在的修饰位点是:酰胺化位点(优选位于22~25位和/或 30~33位）；糖基化位点（在150~153位，156~159位和/或204~207位）；及十四酰化位点 (优选位于94~99位，149~154位，168~173位，175~180位和/或202~207位），以上根据 Falquet et al.，2002命名。
[0033]以下将使用优选的药物指标对本申请的实验数据的关联性进行解释。
[0034]精神分裂症
[0035]精神分裂症为一种严重并致残的精神障碍，具有如幻听、思维混乱以及妄想、情感 缺乏、兴趣缺失、感情迟钝以及冷漠的症状。流行病学、临床学、神经心理学以及神经生理学 研究提供了实质性的证据，证明脑发育以及持续的神经成型异常在其发病机理中扮演着重 要的角色（Arnold et al. 2005) 〇
[0036]认为精神分裂症包括多巴胺能神经传递障碍，而由谷氨酸能神经传递调节多巴胺 能系统则扮演着重要的角色。此观点得到神经调节蛋白和dysbindin基因（其对谷氨酸能系 统具有功能性影响）的遗传学发现的支持(Muller and Schwarz 2006)。变得越来越明晰的 是，现象表明，可能包含有导致精神分裂症的基因（包括神经调节蛋白）的多个区域也与双 相情感障碍有关，此发现得到最近两篇文章的支持（Farmer et al. 2007 ;0wen et al.2007)。
[0037]神经调节蛋白-1，其是精神病易患基因，作用于神经元迀移、轴突导向与髓鞘的形 成，可潜在解释精神分裂症和双相型障碍中异常的解剖学与功能连接的发现(McIntosh et al.2007)。
[0038]有越来越多的重要证据证明神经调节蛋白1与精神分裂症之间存在基因上的联系 (综述:Farmer et al.，2007)。本文提到了神经调节蛋白-1引起的谷氨酸