罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药技术领域，具体涉及罗汉果皂甙提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制 剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种综合病症。主要是由于体内胰岛素 相对或绝对不足所引起的糖代谢紊乱所致。糖尿病患者在长期高血糖的状态下可产生多种 并发症。现今所报道的各种降糖物质的机制有所差异，常为多靶点、多效应、多途径的综合 作用，其中通过抑制a-葡萄糖苷酶的活性，延缓总体碳水化合物的消化时间，降低餐后高血 糖，防治糖尿病并减少糖尿病并发症，被认为是控制Π 型糖尿病的理想途径。临床上应用的 α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物主要为:阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。由于阿卡波糖等均 为合成药物，口服时会出现恶心、呕吐等胃肠道不良反应。因此，越来越多的学者开始青睐 于从药用植物中筛选天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂，以期待寻找到安全并有效的药物。
[0003] 罗汉果（Siraitia grosvenorii(swingle)C.Jeffrey)为广西特色中药，研究表 明，强甜味的非糖物质三帖类成分罗汉果皂甙是其主要的有效成分，具有多种生物活性。目 前关于罗汉果皂甙降血糖方面，有研究表明罗汉果皂甙粗提物在高血糖环境中能有效地保 护血管的内皮细胞，增强血管自身的舒张因子功能。周英等发现罗汉果提取物对于在体外 培养的胰岛β细胞具有刺激其胰岛素分泌的作用。Suzuk等认为罗汉果提取物有抑制麦芽糖 酶的活性，从而能抑制大鼠进食麦芽糖后的血糖生成。何伟平等研究发现罗汉果皂甙能降 低血清中游离脂肪酸，并减轻糖尿病发展过程中的氧化应激，减轻血管内皮损伤。张丽勤等 研究表明罗汉果皂甙粗提物对于糖尿病小鼠具有降血糖，降血脂，调节免疫及抗氧化功能。 而有关罗汉果粗提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的相关研究尚未见有关报导。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种罗汉果皂甙提取物的新应用，具体为罗汉果皂甙在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现技术目标：
[0006] 罗汉果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
[0007] 其中所述的罗汉果皂甙提取物的药物和保健品的剂型是胶囊剂、片剂、颗粒剂或 口服液中任意一种。
[0008] 所述的罗汉果皂甙提取物用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂由下列方法制备：
[0009] (1)挑选果龄为40~50d的罗汉果鲜果，清洗去毛后，真空冷冻干燥，粉碎机粉碎， 过20~100目筛，备用；
[0010] (2)取粉碎后的罗汉果粉末，按照1:30~60(w/v)的料液比，加入60~80 %的乙醇， 70~80 °C的水浴锅中加热回流提取1~3h，过滤，得滤液，滤渣重复提取1~3h，过滤，合并前 后两次滤液，3000~5000r/min离心20~40min，得上清液，真空浓缩干燥后备用；
[0011] (3)取一玻璃层析柱，大孔吸附树脂湿法装柱，将上述提取物用水溶解后上柱，流 速为1~2mL/min，上样结束后，用纯水冲洗柱子至流出液无色，然后用3~5倍柱体积60~ 70 %乙醇溶液进行洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，旋转蒸发浓缩，得浓缩液；
[0012] (4)取一玻璃层析柱，离子交换树脂湿法装柱，取得到的上述浓缩液上样，流速为1 ~2mL/min，吸附完成后，用纯水以5~7mL/min的流速洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，经旋转 蒸发浓缩和真空干燥，得到罗汉果皂甙粗提物粉末，所述的罗汉果皂甙粗提物粉末中罗汉 果皂甙V含量为30~35%、罗汉果皂甙IV含量为10~14%和罗汉果皂甙III的含量为10~ 14%〇
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 本发明研究表明，罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其对 α_葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制，且对α-葡萄糖苷酶内源性荧光产生强烈的静态猝 灭作用。提示罗汉果皂甙提取物可在制备治疗及辅助治疗Π 型糖尿病的食品、保健食品及 药品中应用。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明的罗汉果皂甙V的标准曲线图；
[0016]图2为本发明的罗汉果皂甙IV的标准曲线图；
[0017] 图3为本发明的罗汉果皂甙III的标准曲线图；
[0018] 图4为本发明的阿卡波糖(a)及罗汉果皂甙粗提物(b)对α-葡萄糖苷酶的抑制效果 图；
[0019]图5为本发明的罗汉果阜戒粗提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 曲线；
[0020] 图6为本发明的罗汉果粗提取物在310Κ下对Cl-葡萄糖苷酶荧光的猝灭作用（c)和 在298Κ、303Κ、310Κ下与α-葡萄糖苷酶作用的荧光猝灭曲线(d)。
【具体实施方式】
[0021] 为了更详细的说明本发明，给出下述实例，实例中所用的罗汉果皂甙提取物即为 上述方法制备的罗汉果皂甙粗提物，罗汉果皂甙粗提物的有益效果可以说明罗汉果皂甙提 取物的有益效果，但本发明的范围并不局限于此实施例。
[0022] 实施例:罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制
[0023] 1.1试剂及主要仪器
[0024] 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（CAS:3767-28-0)、a-葡萄糖苷酶（CAS:9001-42-7)均 购于美国sigma公司；阿卡波糖购于德国拜耳公司；其它试剂均为国产分析纯。美国Bio-tek SynergyTM HT超级多功能酶标仪，美国Biotek公司；瑞士 Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant酶标仪，瑞士 Tecan集团公司。
[0025] 1.2实验方法
[0026] 1.2.1罗汉果皂甙提取物的制备
[0027] (1)挑选果龄为40~50d的罗汉果鲜果，清洗去毛后，真空冷冻干燥，粉碎机粉碎， 过40目筛，备用。
[0028] (2)取粉碎后的罗汉果粉末，按照1:40(w/v)的料液比，加入70 %的乙醇，80°C的水 浴锅中加热回流提取2h，过滤，得滤液，滤渣重复提取2h，过滤，合并前后两次滤液，4500r/ min离心30min，得上清液，真空浓缩干燥后备用。
[0029] (3)取一玻璃层析柱，LXA-8大孔吸附树脂湿法装柱，将上述提取物用水溶解后上 柱，流速为2mL/min。上样结束后，用纯水冲洗柱子至流出液无色，然后用三倍柱体积60%乙 醇溶液进行洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，旋转蒸发浓缩，得浓缩液。
[0030] (4)取一玻璃层析柱，700B离子交换树脂湿法装柱。取得到的浓缩液上样，流速为 2mL/min。吸附完成后，用纯水以5mL/min的流速洗脱，同时收集洗脱液，抽滤，经旋转蒸发浓 缩和真空干燥，可得罗汉果皂甙粗提物粉末，总皂甙的含量在75 %以上。
[0031] 1.2.2制作标准曲线
[0032]用10%的乙腈做溶剂，准确称取一定量的罗汉果皂甙粗提取物，配制成浓度为 lmg/mL的溶液，0 · 22μηι微孔滤膜过滤，待测。
[0033] (1)高效液相色谱条件为：色谱柱，Waters ODS Ci8(4.6mmX 150mm I .D.5ym);流 速:0.8mL/min;检测波长:203nm;进样量：IOyL;流动相:0.1% (v/v)磷酸水(A)和乙腈(B)梯 度洗脱，0min:10%B;10min，17%B;20min，17%B ;30min，20%B;40min，20%B;50min，23% B;60min，23%B;70min，26%B;80min，26%B。
[0034] (2)标准曲线的制作：用10 %的乙腈作溶剂，分别配制浓度为Omg/mL、0.4mg/mL、 0 · 6mg/mL、0 · 8mg/mL、I · Omg/mL的罗汉果皂甙V、罗汉果皂甙IV和罗汉果皂甙III的标准溶 液，按上述液相色谱条件，以高效液相色谱峰面积-含量分别作罗汉果皂甙V、罗汉果皂甙IV 和罗汉果皂甙III的标准曲线，得到三种标准品的标准曲线方程。
[0035] 1.2.3罗汉果皂甙提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的分析
[0036]反应体系以4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物建立筛选模型。在96孔板上 加入a-葡萄糖苷酶(0.32U/mL，IOyL)、不同浓度罗汉果提皂甙提取物样品溶液（IOyL)与pH =6.8的磷酸盐缓冲溶液(5(^1^)于37°(：中孵育1〇1^11，再加入4-硝基-€[-0-吡喃葡萄糖苷 (PNPG) (10yL，2.5mM)，放入 37°C恒温 Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant 酶标仪中反应 15min，以Na0H( 20yL