抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是当今严重威胁人类健康的三大疾病之一。血管抑素受体(Ang1statinReceptor FlFO-ATP合成酶)对肿瘤细胞中ATP合成起重要作用。在正常人体组织中，血管抑素受体主要在线粒体内膜上定位，但也有少量存在于内皮细胞的细胞膜上。相对而言，很多肿瘤细胞超量表达血管抑素受体，并大量定位于细胞膜上。因而肿瘤细胞膜上的血管抑素受体是一个潜在的抗肿瘤药物靶标。
[0003]单克隆抗体市场作为制药行业中增长最快、获利最大的市场之一，其2003和2004年间的增长率已经达到了 48.1%。由于受从嵌合体、人源化到完全人源化抗体等一系列技术发展的推动，这一市场份额在未来6年内有可能上升三倍。随着生物技术的发展，单克隆抗体经历了从鼠源单抗、人源化/嵌合单抗、人单抗和全人单抗四个主要发展阶段。单克隆抗体的上述四个发展阶段使鼠源性蛋白成分分别从100%，下降至33%，乃至0%，成为真正的全人抗体。目前治疗性单克隆抗体药物的临床指征覆盖了恶性肿瘤、自身免疫性疾病、传染性疾病，尤其是在癌症和疑难杂症的治疗方面疗效突出。
[0004]全人抗体药物是利用人一人杂交瘤技术开发的单克隆抗体药物，与现有药物比较具有以下优点:1、全人抗体，无副作用；2、技术更为简便，高通量筛选，开发周期短。3、生产工艺简单，抗体产量高；4、与人体内天然产生的抗体完全一致。截至2006年，美国FDA已批准35个抗体药物，其中，人源化抗体占60%，全人抗体占20%，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。
[0005]纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景，特别是纳米药物载体。这种技术是以纳米颗粒作为药物载体，将药物等治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。目前美国生物科学公司已研制出了一种紫杉醇白蛋白纳米悬浮液(AB1-007)，已经在欧美上市并应用于临床。虽然临床研究结果显示，AB1-007所引起的毒副反应明显轻于同剂量的注射液，但ABI — 007还是会引起骨髓抑制，粒细胞减少等副反应。因此，对紫杉醇纳米制剂做更进一步的改进，开发一种具有靶向治疗效果的紫杉醇纳米制剂将可提高靶细胞的药物浓集、增加药物疗效具有更重要意义和广泛的临床应用前景。
[0006]传统的治疗模式(手术、放疗、化疗)依然是肿瘤治疗的主要手段。然而，临床绝大多数抗癌制剂仍不能区分癌细胞与正常细胞，结果导致了系统性的毒性与严重副作用。所以提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向抗肿瘤纳米药物的研究正日益受到人们的普遍关注和重视。纳米技术和纳米生物学研究的进一步深入已对医药业产生了巨大的影响，特别是纳米药物载体在药物传递系统(DDS)可发挥重要作用。目前研究的热点和已有较好基础及做出实质性成果的是药物纳米载体和纳米颗粒基因转移技术。这种技术是以纳米颗粒作为药物和基因转移载体，将药物、DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一类新型的纳米载体，它同时具有亲水性基团及疏水性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束，并完成对药物的增溶和包裹它具有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，且可使药物能逃避单核巨噬细胞吞噬。因此，推进靶向治疗的有效靶点的研究发现具有重要意义，结合纳米技术研究新一代治疗药物与治疗方法，具有重大的科学意义与社会意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用。
[0008]本发明的另一目的是提供包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束及其制备与应用。
[0009]本发明一方面提供了一种抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束，该纳米胶束是将抗血管抑素受体单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物连接后形成。该纳米胶束为具有亲水端和疏水端的两亲性纳米胶束。
[0010]较佳的，上述纳米胶束中，抗血管抑素受体单克隆抗体与羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩尔比为1:500-1:10000。
[0011]本发明第二方面，提供了抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束的制备方法，步骤如下:
[0012]I)羰基化嵌段聚合物P123 (CT-P123)的合成与表征；
[0013]2) CT-P123与抗血管抑素受体单克隆抗体的连接。
[0014]本发明第三方面，提供了抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束用作药物载体。
[0015]本发明的抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束可以用作药物载体，使得被包裹的药物能够更加准确地识别靶位，因此在提高药物治疗效果的同时，也降低了药物的毒副作用。
[0016]本发明第四方面，提供了一种包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束，该免疫胶束是以上述抗血管抑素受体单克隆抗体纳米胶束作为载体，在该载体中包裹有紫杉醇。
[0017]较佳的，上述免疫胶束中，抗血管抑素受体单克隆抗体纳米胶束与紫杉醇的质量比为 40-400:1。
[0018]本发明第五方面，提供了包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法，步骤如下:采用星点法将紫杉醇包裹进抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束中。
[0019]本发明第六方面，提供了包裹紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0020]本发明中包裹了紫杉醇的抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束既能使药物送到一定的靶位，发挥紫杉醇与抗血管抑素受体单克隆抗体的抗肿瘤作用，特异性杀伤肿瘤细胞及新生血管内皮细胞，并延长药物在肿瘤部位的作用时间；显示出更优越的抗肿瘤活性和更小的毒副作用。同时，本发明的免疫胶束采用纳米粒子制备技术，表面改性等技术，在体内减轻纳米载药颗粒与血清成分的相互作用，减小其被清除系统吞噬的概率，延长在血液循环系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了抗体半衰期短的缺点，在保持其抗体活性的同时，使之更适合体内应用。与现有的单抗药物相比，可以大大降低用药频率。
【附图说明】
[0021]图1抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束的制备方法流程图
【具体实施方式】
[0022]本发明用二维液相色谱分离技术获得了与转移相关的蛋白HA1-178，该蛋白为ATP合成酶的同源物，然后利用高效与高通量(HET-FAT)全人抗体技术，获得高表达工程细胞株，制备出抗血管抑素受体人源化单克隆抗体。在此基础上，将羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物与抗血管抑素受体单克隆抗体结合制得抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束。然后采用星点设计法优化将广谱抗癌药紫杉醇包裹于上述纳米胶束中，制得抗血管抑素受体单克隆抗体结合免疫胶束。
[0023]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:试验手册(New York:Cold Spring Har