用于治疗雄性不育症的抗体、化合物及其衍生物的利记博彩app

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【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及选择性地与RANKL/OPGbp结合并且调节RANKL/OPGbp与RANK/0PG之间 的相互作用的拮抗剂或抑制剂。特别地，本发明涉及用于治疗、预防或减轻雄性不育症或雄 性生育力降低(例如，少精子症或无精子症)的、与RANKL/OPGbp肽具有免疫反应性的抗体或 抗原结合域、其片段或衍生物。
【背景技术】
[0002] NF-κΒ受体活化因子配体（receptor activator of NF-κΒ IigancURANKL)系统被 认为对骨的体内稳态很重要并且包括三个重要因子。RANKL是与邻近细胞上的特异性受体 (NF-κΒ的受体活化因子(RANK))结合的跨膜配体，该特异性受体随后活化NFKB并且通过调 节细胞周期（即，增殖、分化和细胞凋亡)来调节细胞活化。OPG是结合RANKL并且抑制其信号 传导的内源性分泌蛋白。
[0003] RANK/RANKL触发促进破骨细胞分化的TRAF介导的激酶级联的网络。RANKL在成骨 细胞上表达并且其受体，Rank，在前破骨细胞上表达。RANKL表达受到许多因子的刺激，例 如，IL-l、IL-6、IL-ll、IL-17、TNF-α、维生素 D、Ca2+、甲状旁腺、糖皮质激素、前列腺素 E2和免 疫抑制药物，并且TGF-α下调RANKL表达。RANK/RANKL的相互作用诱导多核的成熟破骨细胞 的分化和形成，从而导致骨重吸收。第三蛋白激动剂，骨保护素(OPG)，也由成骨细胞产生， 并且已知对前破骨细胞的分化过程发挥抑制作用。OPG通过结合到RANKL，也称为骨保护素 结合蛋白（OPGbp)，抑制RANK/RANKL相互作用和后续的破骨细胞生成。OPG因此是非常有效 的抗吸收剂。它也用作肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的诱饵受体并且通过阻碍 这种配体的细胞凋亡作用来增加细胞存活率。小鼠中OPG的过表达导致重度骨硬化病并且 OPG缺失的小鼠患有骨质疏松症的事实证明了OPG的生理学重要性。缺失RANK或RANKL诱导 小鼠的骨硬化病。
[0004] 因此，RANK/RANKL系统对骨再吸收细胞(破骨细胞)的活化至关重要。在骨中，骨合 成细胞(成骨细胞)表达向未成熟的破骨细胞上的RANK传导信号的RANKL。这诱导细胞的增 殖和活化，并且它们开始增殖并再吸收骨。OPG由骨中的体细胞产生并且这种产生受到性激 素、TGF-B和各种其他物质的调节。现在，人们制备了抗RANKL的重组抗体，狄诺塞麦 (denosumab)用于治疗骨质疏松症，因为它抑制RANKL的信号传导并且因此引起人体中的更 少的骨再吸收。RANKL信号传导在健康人体中仅具有两种另外的已知的额外功能，因为它涉 及哺乳细胞和免疫细胞。
[0005] 最近，已经公开了使用RANK/RANKL拮抗剂治疗神经肌肉疾病、遗传性肌病和/或非 遗传性肌病，和/或用于调节骨骼肌和心肌废用、疾病和老化(W0 2013/067639 Al)。
[0006] 降低的精液质量是雄性不育症的主要因素。精液质量是精液完成受精的能力的度 量标准。如今雄性生育潜力的评价基本上通过精液分析进行。精液分析评价雄性精液的某 些特性以及精液中包含的精子。评价精子质量所测量的最常见的变量是:精子计数、运动性 和形态。
[0007] 然而，当今无法治疗射精没有精子的男性或者没有能够增加精子数量的药物。

【发明内容】

[0008] 在患有生精障碍或具有原位瘤的重度睾丸发育不全的活组织检查中，似乎看来在 管周细胞中不产生OPG。这表明有可能用RANKL的拮抗剂或抑制剂(例如，拮抗性的抗RANKL 抗体)治疗人，这些拮抗剂或抑制剂可以影响生殖细胞的增殖和细胞凋亡。因此，拮抗性的 抗RANKL抗体，例如，狄诺塞麦，可以具有新适应症作为没有精子但是睾丸中存在生殖细胞 的男性的治疗。可替代地，相对物(RANKL)可以用于获得相反效果的男性生育控制。
[0009] 本发明人现在已经解释了 RANKL、RANK和OPG在人和小鼠的睾丸中在RNA和蛋白水 平均表达。塞尔托利氏细胞表达RANKL，而生殖细胞表达RANK并且管周细胞表达OPG。正常 地，RANKL活化NFKB，并且在雄性性腺中此途径的活化决定了睾丸细胞在睾丸中是增殖还是 经历细胞凋亡。因此，此途径似乎是生殖细胞增殖的新的调节子。这在实施例3-5中有进一 步记载，实施例3-5显示了特异性化合物（以OPG说明）和特异性抗体（以狄诺塞麦说明）能够 正面影响精液质量。
[0010] 本发明的目的是提供诘抗剂或抑制剂，例如，调节RANKL和RANK之间的相互作用的 抗体或抗原结合域，特别是阻碍RANKL和RANK之间的相互作用和/或抑制RANKL的至少一种 活性(其导致雄性不育症或雄生育力降低)的抗体或抗原结合域。本发明的另外的目的是提 供可用于治疗、预防或减轻雄性不育或雄性生育力降低的抗体或抗原结合域、其片段或衍 生物。本发明的另外的目的是提供调节睾丸中RANKL和RANK的相互作用并且中和RANKL的至 少一种活性的抗体、抗原结合域或其片段或变体。所述抗体或抗原结合域、其片段或衍生物 可用于治疗、预防或减轻男性不育或男性生育力降低，例如精子减少症或无精子症。
【附图说明】
[0011]图1示出了来自标记为1-23的人样本的选择的转录物的RT-PCR。两个不同的引物 集(primerset)检测正常的和病态的睾丸组织中的RANKL的两种不同的同种型。RANK和OPG 也在正常的和病态的睾丸样本中表达，并且与正常睾丸相比OPG表达在CIS和精原细胞瘤中 消失。有趣的是，仅一种RANKL同种型仅在塞尔托利氏细胞中表达，并且这种同种型在表示 性别特异性的RANKL同种型的卵巢中不表达。这种同种型在NTera2细胞中不表达，而在 TCAM2细胞中表达。RANK在非精原细胞瘤中不存在或者弱表达，而NFKB和RELa+b在所有样本 中均表达。
[0012]图2A示出了来自具有正常维生素 D受体(Vdr wt)或具有突变的和无活性维生素 D 受体(Vdr K0)的瑞士小鼠的选择的转录物的RT-PCR。引物集检测正常小鼠中的RANKL，而表 达在Vdr KO小鼠中很低或不存在。RANK、OPG、RELa在所有动物中均表达，而NFKB看起来在 Vdr KO小鼠中表达较低。
[0013]图2B示出了来自具有正常Vdr(wt)、一个无活性等位基因（+/-)或两个失活的等位 基因（-/_)的小鼠的RANKL的定量PCR。杂合和纯合突变小鼠中的RANKL的显著下调表明主同 种型为RANKLl，因为它由维生素 D调节，而同种型3并非如此。
[0014]图3示出了 RANKL和RANK除在正常小鼠的睾丸中表达之外在从人获得的正常睾丸 和原位癌小管中的免疫组织化学表达。RANK在生殖细胞中表达，而RANKL在塞尔托利氏细胞 和生殖细胞的后期阶段中表达。
[0015]图4:在正常培养基中生长14小时+4小时的NT2细胞在用刃天青染料处理20小时之 后的存活率/增殖。所有处理的浓度为l〇〇ng/ml。值为平均值土标准差(η = 8)，其中*表示在 t检验之后的显著性差异ρ〈0.05。
[0016] 图5:在正常培养基中生长10小时+6.5小时的TCam-2细胞在用刃天青染料处理4小 时和20小时之后的存活率/增殖。所有处理的浓度为100ng/ml。值为平均值土标准差(η = 8)，其中*表不在t检验之后的显著性差异ρ〈0.05。
[0017] 图6示出了在人的离体模型中的生殖细胞增殖。生殖细胞增殖在用媒介物(DMSO)、 100ng/ml RANKL或100ng/ml狄诺塞麦对人的睾丸样本(Ν=3)进行48小时处理之后通过 BrdU合并进行评估，还与用50ng/ml 0PG、100ng/ml CSF-1和100ng/ml PTHrP处理的一个睾 丸进行比较。数据表示为增殖+标准误差的平均变化，并且数据归一化为载体处理的样本。
[0018] 图7示出了在包含管内原位癌细胞的离体人睾丸模型中用RANKL、CSF-1、狄诺塞麦 和对照处理的增殖(上）和细胞凋亡（下）的影响。已经统计了表达BrdU或半胱天冬酶3的生 殖细胞的平均数以比较处理之间的效果。
[0019 ]图8示出了用媒介物、OPG或RANKL处理的小鼠的总睾丸重量。在15只小鼠经过14天 处理(5只小鼠随机进行每项处理:媒介物、RANKL或0PG)之后评估睾丸重量。数据表示为平 均值+标准误差，并且数据归一化为媒介物处理的样本。*表示P〈〇. 05并且***表示p〈0.001。
[0020] 图9示出了用媒介物、OPG或RANKL处理的小鼠的总附睾重量。在15只小鼠经过14天 处理(5只小鼠随机进行每项处理:媒介物、RANKL或0PG)之后评估睾丸重量。数据表示为平 均值+标准误差，并且数据归一化为媒介物处理的样本。NS表示p>0.05并且*表示p〈0.05。
[0021] 图10示出了 10周龄小鼠的睾丸形态测量数据。来自10周龄小鼠的睾丸固定在波恩 氏溶液中并且评估具有生殖细胞上皮(6-12阶段)的生精小管(每个处理组N=3)。用媒介物 或OPG处理14天的小鼠的小管直径(上）和生殖细胞上皮宽度（下）的比较。竖条表示平均值 土标准误差。
[0022]图11示出了用媒介物或OPG处理的小鼠的精子计数。将附睾尾部剁碎置于Iml的 PBS中，随后评估精子计数(5只小鼠随机用媒介物或OPG处理）。数据表示为平均值+标准误 差，并且*表示P〈〇. 05。
[0023]现在将在下文中更详细地描述本发明。
【具体实施方式】
[0024] 定义
[0025] 在更详细地讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定：
[0026]本发明的抗体和抗原结合域选择性地结合到RANKL/OPGbp，其以比其他抗原更大 的结合亲和力优先结合到RANKL/OPGbp。该抗体可以选择性地结合到人的RANKL/OPGbp，而 且还可检测地结合到非人RANKL，例如，鼠 RANKL。可替代地，该抗体可以排他地结合到人的 RANKL或RANK，而不分别可检测地结合到非人RANKL或RANK。
[0027]术语"单克隆抗体"指的是从基本上同质的抗体群体获得的抗体，其中每个单克隆 抗体通常将识别抗原上的单个表位。术语"单克隆"不限于用于制备抗体的任何特定方法。 例如，本发明的单克隆抗体可以通过如Kohler等人(Nature256,495 (1975))描述的杂交瘤 方法制备，或者可以例如使用如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。
[0028] 术语"抗原结合域"或"抗原结合区"或"其片段或衍生物"指的是包含与抗原相互 作用并且在结合剂上赋予其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的选择结合剂的部 分(例如抗体分子）。优选地，抗原结合区将具有人类起源。在其他实施方式中，抗原结合区 可以源自于其他动物物种，特别是家畜和啮齿动物，例如，兔子、大鼠或仓鼠。
[0029] 术语"有效量"和"治疗有效量"在关于抗体或抗原结合区、其片段或衍生物、与 RANKL肽具有免疫反应性使用时指的是支持在RANKL的一个或多个生物活性水平的可观察 的变化有用或必要的选择结合剂的量，其中所述变化可以是RANKL活性水平的增大或减小。
[0030] 在本发明的上下文中，术语"序列同一性"表示两个氨基酸序列之间或两个核酸序 列之间的同源性程度的定量测量。如果将要比较的两个序列不具有相同的长度，那么它们 必须比对以得到最佳的可能匹配，从而允许在多肽序列或核苷酸序列的端部插入空位或可 替代地截尾。序列同一性可以计算为^^其中Ndif是两个序列在比对时的不同残基 的总数，并且其中Nref是一个序列中的残基数量。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC 具有75%的序列同一"性(Ndif = 2并且Nref = 8)。空位计算为具体残基的不同一"性，即，DNA 序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75%的序列同一性(Ndif = 2并且Nref = 8)。
[0031] 相对于涉及氨基酸序列或核苷酸序列的本发明的所有实施方式，一个或多个序列 之间的序列同一性的百分比也可以基于使用〇1118七311软件（111^口：/'\^￥.613；[.3(3.111^/ clustalW/index.html)(默认设置）的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置是：比对 (Alignment) = 3Dful 1，空位开放(Gap Open) 10 · 00，空位延伸（Gap Ext · )0 · 20，空位分隔距 离(Gap separation Dist. )4，DNA权矩阵（DNA weight matrix):同一性（IUB)。对于氨基酸 序列比对，这些设置如下：比对(Alignment) = 3Dful 1，空位开放(Gap Open) 10.00,空位延 伸（Gap Ext. )0.20,空位分隔距离（Gap separation Dist. )4,蛋白质权矩阵（Protein weight matrix):Gonnet0
[0032] 可替代地，核苷酸序列可以通过使用程序DNASIS Max进行分析，并且可以在 http :// www.paralign.org/完成序列比较。这种服务基于两种比较算法dlSSmith-Waterman(SW)和ParAlign。第一种算法由Smith和Waterman出版（1981)，并且是寻找两个序 列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法，Par AI i gn，是用于序列比对的探索法，Ro gn e s (2001)出版了这些方法的细节。使用得分矩阵和空位罚分以及E值(E-value)的默认设置。
[0033] 用于医疗用途的化合物
[0034]在第一方面，本发明提供了一种化合物，该化合物是与NF-KB(RANK)的受体活化剂 结合的NF-kB配体(RANKL)的骨保护素结合蛋白（OPGbp)/受体活化剂的拮抗剂或抑制剂，用 于刺激睾丸中的（生殖)细胞增殖，和/或用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症，和/或 用于诱导或提高哺乳动物的雄性生育力。
[0035] 该化合物特别地可以是能够与RANKL结合的试剂。
[0036] 另外，该化合物可以是选择性结合到RANKL的蛋白质结合剂。
[0037]因此，根据本发明的特定实施方式，如上所述供使用的化合物选自由0PG、包括OPG 的融合蛋白（例如，Fc-OPG)和人免疫球蛋白Gl组成的组。在实施例4和图6中，提供了表示 OPG对生殖细胞增殖的影响的数据。在实施例5和图8至图11中，提供了示出在体内实验中 OPG对小鼠的睾丸参数的影响的数据。
[0038]在本发明的具体方面，本发明涉及用于刺激睾丸中的（生殖)细胞增殖和/或用于 治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症和/或用于诱导或提高哺乳动物(例如少精子症或无 精子症）的雄性生育力的OPG、包括OPG的融合蛋白（例如，Fc-OPG)和人免疫球蛋白Gl。
[0039] 在SEQ ID NO: 1和3中分别示出了鼠和人RANKL的核苷酸序列和预测的氨基酸序 列。此外，在SEQ ID NO 2和4中分别示出了鼠和人RANKL氨基酸序列。
[0040] RANKL序列的计算机分析表明RANKL是2型跨膜蛋白。因此，根据预测，鼠 RANKL蛋白 包括47个氨基酸的胞内域、21个氨基酸的跨膜域以及247个氨基酸的胞外域。根据预测