姜黄素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎PPAR-γ和COX-2影响的模型建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及溃瘍性结肠炎干预模型建立方法，特别设及姜黄素对DSS诱导的小鼠 溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和C0X-2影响的模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 溃瘍性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚不十分清楚的直肠和结肠 慢性非特异性炎症性疾病，病变主要局限于大肠粘膜与粘膜下层，病变成连续性弥漫分布， 范围多自肛端直肠开始，逆行向近段发展，甚至累及全结肠及末端回肠，属于炎症性肠病 (inflammatory boweldisease, IBD)之一。本病呈慢性过程，且大部分患者反复发作，近年 来由于治疗水平提高，病死率已明显下降，但是慢性持续性活动或反复发作频繁，预后较 差，且病程漫长者癌变危险性增加。
[000引过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome pro Iif erator-activated receptor，PPAR)是一组具有复杂功能的核受体超家族成员，有PPARa、PPARfVS、PPAR 丫 3种 亚型，分别由不同的基因编码，PPAR是配体调节的转录因子，PPAR 丫由配体激活，主要参与 炎症、免疫反应的调节，有减轻溃瘍性结肠炎患者及结肠炎动物模型的炎症反应作用。
[0004] 环氧合酶-2 (eye looxygenase-2, C0X-2)是启动子含NF-KB结合位点的一种诱生型 酶，在正常情况下不表达，而在有炎症时高度表达，在UC的发病中起重要作用，C0X-2作为促 炎症介质和促细胞分裂刺激早的反应表达，在慢性结肠炎增加的前列腺素产物依赖于COX-2的活性，C0X-2是催化花生四締酸生成前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)的关键酶， PGE2具有扩血管、增加肠黏膜通透性和刺激肠上皮细胞分泌的作用，可能与UC腹痛、腹泻的 发生有关。
[0005] STAT是一个重要的细胞内信号转导分子，STAT蛋白质是一个含有STAT1/2/3/4/ 5a/化/6的蛋白质家族，在没有特殊受体刺激时STAT在细胞质中保持无活性形式，与多个炎 症因子的表达相关，它在UC的发病机制中有重要作用。在不同的刺激如细胞因子、生长因 子、激素类等，STAT蛋白质迅速通过酪氨酸憐酸化而被激活。在UC的作用机制中，STAT的家 族成员之一 STAT3在UC发病机制中的重要作用已经在实验研究和临床研究中得到证实。
[0006] 姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种色素，为澄黄色结晶粉末，味稍苦，酸性多 酪类物质，主链为不饱和脂族及芳香族基团，大量研究证明它具有抗氧化、抗炎、抗凝、降 月旨、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等作用。
[0007] 溃瘍性结肠炎主要药物治疗有氨基水杨酸制剂，但此类药物不良反应多，且临床 疗效不甚令人满意，而5-ASA新型制剂不良反应明显减少，缺点是价格昂贵，因此需要研发 新的药物，此药既能更好的对溃瘍性结肠炎起良好疗效，同时副作用少且经济实惠。姜黄素 对溃瘍性结肠炎的研究近年来有所进步。由于葡聚糖硫酸钢(DSS)诱导的溃瘍性结肠炎 化C)小鼠与人UC的组织学与临床表现类似，为目前较好的研究人UC的动物模型，DSS诱导模 型之所W在I抓研究中受欢迎是由于它的迅速、简单、再现性、可控制性。本课题通过对正常 小鼠、DSS模型小鼠各组治疗前后的生物行为、病理学、免疫组织化学、分子生物学研究，巧U 定PPAR 丫、C0X-2、STAT3的表达，观察姜黄素对溃瘍性结肠炎的干预作用，探讨姜黄素治疗 溃瘍性结肠炎的可能机制。
【发明内容】
[0008] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供姜黄素对DSS诱导的小 鼠溃瘍性结肠炎PPAR-丫和C0X-2影响的模型建立方法。通过观察姜黄素对DSS诱导小鼠溃 瘍性结肠炎的疗效;观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况、临床症状、结肠组织学损伤、宏 观表现;测定结肠黏膜层PPAR 丫、C0X-2表达情况，及STAT3mRNA和憐酸化STAT3，探讨姜黄素 影响溃瘍性结肠炎的可能机制。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0010]姜黄素对DSS诱导的小鼠溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和C0X-2影响的模型建立方法，包 括如下步骤：
[0011] 步骤一、实验分组与模型制造；
[0012] 选雌性BALB/c小鼠数十只、体重16-20g，小鼠适应性喂养一周，随机数字表分为A、 B、C、D、E、F六组，每组数目相同；
[0013] A组:正常对照组，每日自由进饮用水及饲料，每日腹腔注射Iml生理盐水，共7d;
[0014] B组:模型组，每日自由饮用5%DSS溶液，替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注 射Iml的2.5%乙醇溶液，共7d;
[0015] C组:地塞米松治疗组，每日饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔 注射1次地塞米松针剂，剂量为1.5mg/kg. d，溶于Iml生理盐水，共7d。
[0016] L组:姜黄素低剂量组，饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次，姜黄素按每日25mg/kg. d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0017] M组:姜黄素中剂量组，饮用5 %DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次，姜黄素按每日50mg/kg. d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0018] H组:姜黄素高剂量组，饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次，姜黄素按每日lOOmg/kg.d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0019] 步骤二、结肠组织取样；
[0020] 第8天，颈椎脱白处死小鼠，剪开腹腔，游离结肠及远端回肠，取出肛口至盲肠末端 的整个肠段，沿肠系膜纵轴剖开，用冰冷PBS反复冲洗干净，再用清洁滤纸吸干水分。宏观检 查并进行评分后，剪取溃瘍最严重处结肠组织1cm，置于4%甲醒溶液固定，常规石蜡包埋， 切片，留作免疫组化染色。另取两段结肠组织放入低溫冰箱-80°C存放，做RT-PCR和化ISA。
[0021] 步骤=、观察指标；
[0022] 观察造模期间每日重点观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况，并进行DAI积分， 粪便/潜血临床症状评分;宏观检查评分;组织损伤评分；
[0023] 步骤四、生化指标测定；
[0024] 根据上述积分和评分对检测结果进行定性分析，同时，
[002引进一步的，所述步骤一中所选小鼠为60只，每组10只。
[0026]相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0027] 本发明提供了姜黄素对DSS诱导的小鼠溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和COX-2影响的模型 建立方法。通过观察姜黄素对DSS诱导小鼠溃瘍性结肠炎的疗效;观察小鼠的体重、粪便性 状和隐血情况、临床症状、结肠组织学损伤、宏观表现;测定结肠黏膜层PPAR 丫、C0X-2表达 情况，及STAT3mRNA和憐酸化STAT3，探讨姜黄素影响溃瘍性结肠炎的可能机制。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例提供的结肠组织P-STAT3蛋白的表达情况示意图；
[0029] 图2是本发明实施例提供的结肠组织STAT3表达情况(RT-PCR)的示意图；
[0030] 图3是本发明实施例提供的结肠组织光镜下观察化EX200)的示意图；
[0031] 图4是本发明实施例提供的结肠组织PPAR 丫的表达情况(SPX400)的示意图；
[0032] 图5是本发明实施例提供的结肠组织STAT3的表达情况(SPX400)的示意图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0034] 试验例：
[003引一、实验材料
[0036] 1.实验动物:雌性BALB/c小鼠60只、清洁级、鼠龄6-7巧4，体重16-20邑。
[0037] 2.主要实验试剂
[0038] 葡聚糖硫酸钢、姜黄素、地塞米松、PPAR 丫兔抗鼠多克隆抗体、STAT3兔抗鼠多克隆 抗体、C0X-2化ISA检测试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、4 %多聚甲醒固定 液、Trizo 1试剂盒、CDNA合成试剂盒、STAT3上下游基因引物、TraiZO1总RNA提取试剂、反转 录试剂盒、憐酸化STAT3多克隆抗体。
[0039] 二.实验方法
[0040] 1实验分组与模型制造
[0041 ] 选雌性BALB/c小鼠60只、体重16-20g。小鼠适应性喂养一周，随机数字表分为A、B、 C、D、E、F六组，每组10只。
[0042] A组:正常对照组，每日自由进饮用水及饲料，每日腹腔注射Iml生理盐水，共7d;
[0043] B组:模型组，每日自由饮用5 %DSS溶液，替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注 射Iml的2.5%乙醇溶液，共7d;
[0044] C组:地塞米松治疗组，每日饮用5 %DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹 腔注射1次地塞米松针剂(剂量为1.5mg/kg.d，溶于Iml生理盐水），共7d。
[004引L组:姜黄素低剂量组，饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次(姜黄素按每日25mg/kg.d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2]，共7(1。
[0046] M组:姜黄素中剂量组，饮用5 %DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次(姜黄素按每日50mg/kg.d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2，3])，共7d。
[0047] H组:姜黄素高剂量组，饮用5%DSS溶液替代饮用水，自由进食饲料，每日腹腔注射 姜黄素悬液1次(姜黄素按每日lOOmg/kg.d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2])，共7(1。
[004引 2.结肠组织取样
[0049]第8天，颈椎脱白处死小鼠，剪开腹腔，游离结肠及远端回肠，取出肛口至盲肠末端 的整个肠段，沿肠系膜纵轴剖开，用冰