一枝蒿多糖作为疫苗佐剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种免疫佐剂，尤其设及一枝葛多糖在疫苗佐剂中的应用，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 新疆一枝葛(Artemisia rupestris L)系菊科葛属植物，为多年生草本，主要分布 于我国新疆阿尔泰山、天山和昆仑山区。一枝葛是新疆维吾尔医常用药，用于治疗热性感 冒、发热、头痛、肝炎、等麻疹等。W-枝葛为主药的复方制剂，已针对病毒性感冒和过敏性 鼻炎等症在新疆上市销售，临床应用广泛。近十余年研究者们对其化学成分和药理作用等 方面进行了深入细致的研究，发现一枝葛全草含黄酬类、多糖类等多种化学成分，具有抗过 敏、抗氧化、抗病毒、调节免疫等多种作用。
[0003] 疫苗的应用对于控制人类疾病的流行起到了非常重要的作用。新型疫苗，如重组 疫苗、亚单位疫苗、合成多肤疫苗、蛋白疫苗及DNA疫苗等具有良好的抗原特异性和安全性， 应用前景广泛，但免疫原性较差，运些疫苗只有与安全高效的免疫佐剂配合使用才能增强 其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性，发挥良好的预防和治疗效果。新型疫苗成功的关 键依赖高效安全的疫苗佐剂。不论是兽用疫苗研究领域还是人用疫苗研究领域，对疫苗佐 剂数量上和质量上的要求越来越高了。现实状况是原有的疫苗佐剂已不能满足新型疫苗飞 速发展的需要，因此研制高效、安全的疫苗佐剂对于疾病的预防和治疗W及保护人类的健 康具有积极意义。
[0004] 疫苗佐剂能够显著增强疫苗的免疫原性和安全性、节约抗原的用量，是疫苗学领 域研究的重要内容。尽管近年来疫苗佐剂发展迅猛，种类繁多，均存在不同的缺陷，如免疫 效果不理想或毒副作用大等而限制了在人体和动物的应用和发展，能够用于临床的免疫佐 剂种类很少，截止目前，唯一通过抑A批准的人用疫苗佐剂仅有侣佐剂，已经使用了 80多年， 它只能激发体液免疫，不能诱导细胞介导的免疫反应，并且对病毒抗原诱导免疫反应的能 力较差。
[000引理想的新型免疫佐剂应该是对动物机体的细胞或体液免疫均有有效的激发作用、 作用持久稳定、免疫次数减少、副作用小，同时便于生产和易于注射。
[0006] 佐剂发挥作用是由于增强抗原的免疫原性、提高疫苗的免疫效果，因此，佐剂一般 可在多种疫苗中进行使用。如目前的侣佐剂，因此佐剂的研究对感染性疾病的防治有很高 的应用价值。
[0007] 植物来源的多糖对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，又无严重毒副反应而成 为安全、高效新型疫苗佐剂的候选资源。植物来源的免疫活性物质，具有资源丰富、价格低 廉、毒副作用小、无残留等优点，因此植物多糖作为佐剂与疫苗配合使用是佐剂研究发展的 重要途径和新的趋势。
[0008] 经系统的查阅文献和专利，目前未发现一枝葛多糖具有疫苗佐剂作用的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一枝葛多糖（Aqueous extracts of A;rtemisia rupestris L, AEAR)在疫苗佐剂中的应用。
[0010] 本研究发现，一枝葛多糖能够明显刺激血清中抗体I gG、I gGl和I gG2a的产生，对 ConA和LPS刺激的淋己细胞增殖反应明显增高，可W激发淋己细胞分泌产生细胞因子IL-4 和IFN-丫。表明一枝葛多糖不仅诱发了较强的体液免疫反应，而且诱导了较强的细胞免疫 反应，可W用于疫苗佐剂。
[0011] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： 本发明设及所述的一枝葛多糖在疫苗佐剂中的应用。
[0012] 本发明所述的疫苗为蛋白疫苗、基因疫苗、多肤疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗。
[0013] 本发明所述的一枝葛多糖采用超声辅助水提醇沉法提取。本发明通过对新鲜或干 燥的新疆一枝葛粉末，石油酸脱脂，加入蒸馈水超声，滤液浓缩后加入无水乙醇揽拌沉淀， 沉淀物经过离屯、，真空干燥，得到一枝葛多糖的粗制品。
[0014] 再对一枝葛粗多糖用Sevage试剂(氯仿：正下醇=4:1)除蛋白，离屯、，合并上清，重 复上述操作多次，收集上清，加入乙醇，静置过夜，沉淀物经过离屯、，真空干燥，得到一枝葛 多糖可作为疫苗佐剂。
[0015] 本发明使用方法:一枝葛多糖与抗原采用皮下途径一起注射机体。所述的疫苗为 注射制剂，一枝葛多糖在所述注射制剂中的剂量为1.5mg/kg~lOOmg/kg。
[0016] 本发明一枝葛多糖在疫苗佐剂中的应用，通过动物分组及免疫方法、ELISA检测小 鼠血清中抗OVA特异性抗体滴度及细胞免疫学活性等实验，结果证明一枝葛多糖可W作为 蛋白疫苗、基因疫苗、多肤疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗的佐剂，其免疫增强效果明显优于 侣佐剂，其具有副作用小、来源广泛、易于生产，并且本发明的一枝葛多糖的制备过程简单， 成本较低，并且收率较高，有利于大规模生产。
【附图说明】
[0017]图巧小鼠免疫OVA特异性抗体IgG滴度检测结果。
[0018] 图2为小鼠免疫OVA特异性抗体IgGi和IgGsa的检测结果。
[0019] 图3为ConA和LI^刺激小鼠淋己细胞增殖反应的情况。
[0020] 图4为一枝葛多糖佐剂对小鼠淋己细胞增殖的细胞因子IL-4产生的影响。
[0021 ]图5为一枝葛多糖佐剂对小鼠淋己细胞增殖的细胞因子IFN-丫产生的影响。
[0022] 图6为一枝葛多糖佐剂对口蹄疫疫苗IgG抗体水平产生的影响。
[0023] 图7为一枝葛多糖佐剂对口蹄疫疫苗IgGi和IgGsa抗体水平产生的影响。
[0024] 图8为一枝葛多糖佐剂对口蹄疫疫苗小鼠淋己细胞增殖反应的情况。
[002引图9为一枝葛多糖佐剂对口蹄疫疫苗细胞因子IFN- 丫产生的影响。
[0026] 图10为一枝葛多糖佐剂对口蹄疫疫苗细胞因子IL-4产生的影响。
[0027] 图11为一枝葛多糖佐剂对流感疫苗IgG抗体水平产生的影响。
[0028] 图12为一枝葛多糖佐剂对流感疫苗IgGl和IgG2a抗体水平产生的影响。
[0029] 图13为一枝葛多糖佐剂对流感疫苗小鼠淋己细胞增殖反应的情况。
[0030] 图14为一枝葛多糖佐剂对小鼠OVA基因疫苗IgG抗体水平产生的影响。
【具体实施方式】
[0031] W下结合本发明具体实施例，对本发明一枝葛多糖在疫苗佐剂的应用进行详细说 明。 实施例1:不同剂量一枝葛多糖对小鼠免疫模式抗原卵清白蛋白（OVA)的动物实验 本实施例一枝葛多糖的制备方法是： 步骤1:新鲜或干燥的新疆一枝葛粉末，石油酸脱脂，加入蒸馈水超声，滤液浓缩后加入 无水乙醇揽拌沉淀，沉淀物经过离屯、，真空干燥，得到一枝葛粗多糖的粗制品； 步骤2: -枝葛粗多糖用Sevage试剂(氯仿:正下醇为4:1)除蛋白，离屯、，合并上清，重复 上述操作多次，收集上清，加入乙醇，静置过夜，沉淀物经过离屯、，真空干燥，得到一枝葛粗 多糖。
[0032] 实施方法： 实验材料:一枝葛多糖母液配置:〇. Ig的一枝葛粗多糖溶解在IOml生理盐水中，配置成 1 Omg/ml的母液。配置OVA母液:0.01 g OVA溶解在1 Oml的生理盐水中，配置成Img/ml的母液。
[0033] 动物免疫:将6-8周龄ICR小鼠，随机分配成8组，每组6只，实验分组如表1所示。
[0034] 表1小鼠免疫分组
每组疫苗溶解在生理盐水中，每只小鼠注射100微升，第0天皮下注射，第一次注射 后间隔14天进行再次注射，共注射两次。
[0035] 为了检测小鼠体液免疫水平，皮下注射后采血，分离小鼠血清，间接化ISA法分别 检测IgGJgGi和IgGsa抗体水平。W2 iig/ml OVA抗原包被96孔酶标板中，4°C过夜，3%牛 血清白蛋白37°C封闭化；PBST(将Tween 20溶于PBS，使Tween 20终浓度为0.05%得到 的溶液）洗涂4次；加入按不同倍数稀释小鼠血清，37°C解育化；PBST洗涂4次，每次5 分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgGJgGi和IgG2a抗体（Southernbiotech)(均按 1:5000稀释），37°C解育化。每孔加入底物TMB，37°C避光显色5-15min，加入终止液2mol/L 出S〇4,每孔50山，终止显色，置于450nm/655nm测定每孔光密度值，阳性滴度终点为OD