雷酚内酯作为雄激素受体拮抗剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及中药提取物领域，具体地说，设及雷公藤根提取物雷酪内醋在作为雄 激素受体括抗剂方面的应用。
【背景技术】
[0002] 雄激素（Androgen)，如雄酬（Testosterone，T)、二氨雄酬（Dihy化otestosterone， DHT)和肾上腺雄酬等，是人体内一类重要的酱体类性激素，通过与雄激素受体(Arulrogen Receptor, AR)结合促进细胞分化和组织生长，参与众多关键生理功能。男性或女性体内都 存在一定比例的雄激素。在前列腺和皮肤中，雄酬T被5a-还原酶转化为DHT，且与T相比，DHT 对AR的亲和力要高出3-5倍。
[0003] AR是核受体超家族的一个成员，属配体激活的转录因子，广泛分布于增殖和非增 殖组织。AR蛋白具有S个结构域：N端结构域（N termina 1 domain，NTD)、DNA结合域（DNA binding domain,D抓)和配体结合域(Xigan化inding domain，LBD)。其中在LBD结合域有一 个激素结合口袋化Ormone binding pocket，皿P)，雄激素结合于皿P时，AR的化Iixl2发生 构象变化而成为激动构象(Agonistic conformation)，形成二聚化结构，进入细胞核中与 位于祀基因启动子区的雄激素应答原件(An化Ogen response element ,ARE)结合，起到激 活或抑制祀基因表达的作用，从而调控祀组织的生理功能。雄激素受体括抗剂，即为能够和 雄激素竞争占据皿P，并阻止化lix-12处于活性位置的分子。很多AR相关疾病的产生，或是 由于激素水平失常，或是因为受体功能素乱，破坏了正常的相互作用平衡关系。在患病个体 中，药物通过加强或抑制受体活化水平可达到治疗相关疾病的效果。因此，在治疗与雄激素 作用相关的多种疾病和症状当中，AR是重要的祀标。其中雄激素亢奋为男性前列腺癌、前列 腺增生症、性欲亢进等疾病;女性瘦疮，脂溢性皮炎，多毛症，脱发等疾病的重要因素，因而 雄激素受体括抗剂是治疗上述疾病尤其是前列腺癌的重要药物。
[0004] 雄激素受体括抗剂是目前治疗前列腺癌的主体药物。运类药物可分为酱类与非酱 类两种。酱类抗雄激素药物W醋酸环丙孕酬(CPA)为代表，还包括醋酸甲地孕酬和醋酸甲径 孕酬。非酱类抗雄激素药物（Nonsteroidal antiandorgens ,NSAA)有一代的氣他胺 (f Iutamide，FLU)、比卡鲁胺（bicalutamide，BIC)和二代的恩杂鲁胺（enzalutaimide， ENZ)、阿比特龙（abiraterone)。但在治疗中产生的耐药性问题严重影响了运些药物的疗 效，甚至会促进前列腺癌细胞的生长。因而，寻找治疗新型的雄激素受体括抗剂迫在眉睫。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型雄激素受体括抗 剂一一雷酪内醋。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 第一方面，本发明提供了雷酪内醋(CAS号：74285-86-2)作为雄激素受体括抗剂的 应用。
[0008] 雷酪内醋为一种已知化合物，可购自市售产品，也可从雷公藤中提取分离得到，具 体的获取手段为现有技术，本发明对此不作特别限定。
[0009] 雷酪内醋可W抑制野生型W及突变型雄激素受体的活性。突变型雄激素受体包括 877位苏氨酸(T)^丙氨酸(A)，741位色氨酸(W)^亮氨酸化)或者半脫氨酸(C)，876位苯丙 氨酸(F)^亮氨酸化）。其是通过AR基因的点突变而导致了相关氨基酸的突变。该突变的产 生使得药物与AR结合时，AR的构象由括抗剂状态转变为激动剂状态，从而对药物产生耐药 性，制约了相关药物的使用，所W其对克服抗前列腺癌的耐药性问题具有重要意义。
[0010] 发明人经过试验发现，雷酪内醋对T877A突变型受体具有良好的抑制作用。因此作 为优选，将雷酪内醋作为T877A突变雄激素受体括抗剂。T877A突变型受体与氣他胺的耐药 性相关，雷酪内醋可通过抑制T877A突变型受体的活性，达到治疗氣他胺耐药的前列腺癌的 目的。
[0011] 发明人经过试验发现，雷酪内醋对F87化突变型受体具有良好的抑制作用。因此作 为优选，将雷酪内醋作为F87化突变雄激素受体括抗剂。F87化突变型受体与恩杂鲁胺的耐 药性相关，雷酪内醋可通过抑制F87化突变型受体的活性，达到治疗恩杂鲁胺耐药的前列腺 癌的目的。
[0012] 第二方面，本发明提供了雷酪内醋在制备治疗雄激素失调疾病的药物中的应用。
[0013] 本发明所述的治疗雄激素失调疾病的药物W雷酪内醋为活性成分制备而成，具体 为本领域技术人员所掌握。
[0014] 更具体而言，本发明提供的雷酪内醋主要针对由雄激素亢奋引起的疾病，包括男 性前列腺增生症或前列腺癌、性欲亢进、女性瘦疮、脂溢性皮炎、多毛症、脱发等。
[0015] 可选的，所述雄激素失调疾病为前列腺增生症或前列腺癌。需要特别强调的是，由 于前列腺癌的致病机理主要是雄激素受体信号通路发生异常活化。其信号通路过程为雄激 素与AR结合，AR被激活并二聚化憐酸化，进入细胞核中，与特异的DNA部位(AR Response Element ,ARE)结合，募集RNA聚合酶等转录元件，调控祀基因的转录表达，如前列腺特异性 抗原(PSA)、TMPRSS2、F邸P5等基因（图1)。该信号通路正常情况下可W促进前列腺上皮细胞 的分化，而持续激活情况下则会调节细胞增殖、存活等，从而形成肿瘤并恶化。本发明提供 的雷酪内醋正是作用于AR,抑制异常活化的雄激素受体信号通路，从而抑制肿瘤的恶化。因 此，本发明所述的雷酪内醋可对前列腺癌具有显著疗效。
[0016] 可选的，所述雄激素失调疾病为男性性欲亢进。由于男性性欲亢进同样是由雄激 素亢奋引起的疾病，本发明提供的雷酪内醋可通过抑制雄激素受体的活性，达到治疗该疾 病的目的。
[0017] 可选的，所述雄激素失调疾病为女性瘦疮、脂溢性皮炎、多毛症、脱发等。当上述疾 病确由雄激素通路亢奋引起时，本发明所述的雷酪内醋，可有效的对上述疾病进行治疗。
[0018] 第S方面，本发明提供了雷酪内醋在制备男性避孕药物方面的应用。
[0019] 由于雷酪内醋可抑制野生型和突变型雄激素受体的活性，调控雄激素受体信号通 路，从而通过反馈调节对雄激素分泌起到抑制作用。因此，本发明所述的雷酪内醋可作为男 性避孕药物的活性成分，在男性避孕方面有效的实现避孕效果。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 天然产物是药物开发的重要来源，诸多药物如青葛素、奎宁W及紫杉醇都是从天 然产物中发现的。雷公藤作为一味重要的中药，在中药中广泛使用。通过前期筛选和后期机 审Ij研究，本发明发现雷公藤根提取物的单体一雷酪内醋，可W选择性抑制AR依赖的LNCaP细 胞的增殖，对内源性AR及AR-F87化突变体的转录、AR蛋白的表达、AR的核定位均具有很好的 抑制作用，是新型的雄激素受体括抗剂。
[0022]本发明通过构建可靠雄激素活性筛选方法，测试了多类中药提取物对雄激素受体 活性的抑制作用，最后发现雷公藤跟根提取物单体雷酪内醋是一类新型的雄激素受体括抗 剂，可W抑制野生型W及突变性雄激素受体的活性。进一步地，本发明测试了雷酪内醋的抗 前列腺癌的活性，发现雷酪内醋对于A郎日性的前列腺癌细胞如LNCaPW及22RV1具有较好的 活性。
【附图说明】
[002引图巧本发明实施例1中雷酪内醋对PC-3中过表达的野生型AR转录活性的影响。
[0024] 图2为本发明实施例2中雷酪内醋对LNCaP、22RVl细胞内源性的AR转录活性的影 响。
[0025] 图3为本发明实施例3中雷酪内醋对在PC-3中表达的877位氨基酸突变的AR转录活 性的影响。
[0026] 图4为本发明实施例4中雷酪内醋对在PC-3中表达的876位氨基酸突变的AR转录活 性的影响。
[0027] 图5为本发明实施例5中雷酪内醋竞争性结合AR的巧光极化(FP)实验结果。
[0028] 图6为本发明实施例6中雷酪内醋的细胞增殖实验(MTT);其中：A图是在PC-3细胞 中，B图是在22RV1细胞中，C图是在LNCaP细胞中，各组实验均设了S组平行。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1雷公藤单体雷酪内醋可抑制野生型雄激素受体的活性
[00削将1.4X IO5个/mL的PC-3细胞悬液，按照每孔500化接种于24孔板中。待细胞长至 80 %时，每孔共转染IOOng PSA-Iuc、20ngAR-WT和Ing pCMV-Reni 1 Ia质粒。转染后化将培养 基换成含lO^charcoal-stripped FBS的曲enol red-free RPMI 1640培养基；转染24h后， 其中一组按照每孔InM的DHT+相应浓度的雷酪内醋或恩杂鲁胺各加入化L，另一组按照每孔 DMSO或相应浓度的雷酪内醋或恩杂鲁胺加入化L，继续培养2地。最后将培养基吸掉，每孔加 入10化L的1 X化B裂解20min，收集细胞裂解物到干净的EP管中，离屯、，取上清20化到干净的 白色96孔板中，按照Promega公司的Dual-Glo愈Luciferase Assay System试剂盒的说明 书，用Centro XS3 LB 960酶标仪测定巧光值。实验设置了 =组平行，并进行了统计学分析， 其中冲<0.05是WDMSO组为参照，Ap<0 . 05，^P<0.01WDHT组为参照。实验数据W ^ ± 5表 示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图（见图1)和统计学分析。
[0034] 该实验原理是将AR的祀基因前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA)的启动子和蛋火虫巧光素酶基因偶联，W校准后的蛋火虫巧光素酶活性(相对巧光值， 化U)来反映AR的转录活性。实验结果显示，雷酪内醋对野生型的AR转录活性具有很好的抑 制作用，在50nM、500nM、5iiMS个浓度下呈现剂量依赖关系。在±DHT的作用下，50nM的雷酪 内醋就可W显著抑制AR-WT的转录活性，其在