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【专利说明】阳离子神经毒轰
[0001] 本发明设及包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，W及运样的工程化的 梭菌毒素在医学和治疗中的用途。
[0002] 梭菌属中的细菌产生高度强大的并且特异性的蛋白毒素，它们能够毒害它们被递 送之处的神经元和其它细胞。运样的梭菌毒素的例子包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌 (BoNT)血清型A-G产生的神经毒素 W及由己氏梭菌和下酸梭菌产生的那些神经毒素。
[0003] 在所述的梭菌毒素中有一些是已知最强大的毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素对于 小鼠的半数致死剂量化化0)值范围从0.5到5ng/kg，取决于血清型。破伤风梭菌毒素和肉毒 杆菌毒素两者都通过抑制受影响的神经元的功能(特别是神经递质的释放)而起作用。虽然 肉毒杆菌毒素在神经肌肉连接处起作用并且抑制周围神经系统中胆碱能的传导，但是破伤 风梭菌毒素却在中央神经系统中起作用。
[0004] 在自然界，梭菌毒素是W单链多肤形式被合成的，通过一种蛋白酶解切割事件对 该多肤进行翻译后的修饰而形成通过二硫键连接在一起的两条多肤链。切割发生在特异性 的切割位点（常常被称为活化位点）处，即位于提供链间二硫键的半脫氨酸残基之间。正是 运种二链形式成为了所述毒素的活性形式。运两条链被称为重链化-链）（具有大约l〇〇W)a 的分子量)和轻链化-链）（具有大约50kDa的分子量）。所述的H-链包含N-末端易位元件化N 结构域)和C-末端祀向元件化e结构域）。所述的切割位点位于所述的k链和所述的易位结 构域元件之间。在所述也结构域与它的祀标神经元结合W及所结合的毒素经由内体内化到 细胞中W后，所述的化结构域使所述的k链易位跨越内体膜并且进入胞质溶胶中，并且所 述的心链提供一种蛋白酶功能(也被称为一种无细胞毒性的蛋白酶）。
[000引无细胞毒性的蛋白酶通过蛋白酶解切割被称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白（例 如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白）而起作用-参见Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology"(第4版)John Wil巧& Sons, Inc。首字母缩略词SNARE源于术语可溶性的NSF连接 受体，其中NSF意指N-乙基马来酷亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是细胞内的小泡融合体所必需 的，因此是经由小泡转运的来自细胞的分子分泌所必需的。所述的蛋白酶功能是一种锋依 赖性的内肤酶活性并且展示对SNARE蛋白的高度底物特异性。因此，一旦被递送到所要的祀 细胞，所述的无细胞毒性的蛋白酶能够抑制来自所述祀细胞的细胞分泌。梭菌毒素的所述 心链蛋白酶是切割SNARE蛋白的无细胞毒性的蛋白酶。
[0006] 鉴于SNARE蛋白的遍在本性，梭菌毒素例如肉毒杆菌毒素已经被成功地应用在广 泛的治疗中。
[0007] 举例来说，我们参考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack, Inc. ,2004)，它描述了梭菌毒素，例如肉毒杆菌神经毒素 (BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Ci、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G W 及破伤风神经毒素 (TeNT)的用途，用于在广泛种类的治疗和化妆应用中抑制神经元传导-例如，BOTOX?目前被 批准作为下列适应症的治疗剂:弛缓不能、成年人疫李、肛裂、背痛、眼险疫李、夜磨牙症、颈 肌张力障碍、特发性震颤、眉间线或运动机能亢奋的面线、头疼、半面疫李、膀脫活动过度、 多汗症、青少年大脑性擁痕、多发性硬化症、肌阵李症、鼻唇线、疫李性发声困难、斜视和第 屯神经障碍。另外，描述了梭菌毒素治疗用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397);用于 治疗子宫病症（参见US 2004/0175399);用于治疗溃瘍和胃食管反流病（参见US 2004/ 0086531);用于治疗张力失常（参见US 6,319,505);用于治疗眼病（参见US 2004/ 0234532);用于治疗眼险疫李（参见US 2004/0151740);用于治疗斜视（参见US 2004/ 0126396);用于治疗疼痛（参见 US 6,869,610，US 6,641，820、US 6,464,986 和 US 6,113， 915);用于治疗纤维肌痛(参见US 6，623，742、US 2004/0062776);用于治疗下背痛(参见US 2004/0037852);用于治疗肌肉损伤（参见US 6，423,319);用于治疗窦性头疼（参见US 6， 838，434);用于治疗紧张性头疼(参见US 6，776，992);用于治疗头疼(参见US 6，458，365); 用于减少偏头疼性疼痛(参见US 5,714,469);用于治疗屯、血管疾病（参见US 6,767,544); 用于治疗神经性病症例如帕金森氏病（参见US 6，620，415、US 6,306,403);用于治疗神经 精神病(参见US 2004/018006UUS 2003/0211121);用于治疗内分泌素乱(参见US 6,827， 931);用于治疗甲状腺疾病(参见US 6，740，321);用于治疗胆碱能影响的汗腺疾病(参见US 6，683，049);用于治疗糖尿病(参见US 6，337，075、US 6，416，765);用于治疗一种膜腺疾病 (参见 US 6,261，572、US 6,143,306);用于治疗癌症例如骨瘤（参见 US 6,565,870、US 6， 368,605、US 6，139,845、US 2005/0031648);用于治疗耳病（参见 US 6,358,926、US 6,265， 379);用于治疗自主性疾病例如胃肠肌肉疾病和其它平滑肌机能失常（参见US 5，437， 291);用于与皮肤细胞增生性疾病相关的皮肤损伤的治疗(参见US 5,670,484);用于控制 神经原性炎性病症（参见US 6，063，768);用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6，299， 893);用于治疗嘴角朝下（参见US 6，358，917);用于减少食欲(参见US 2004/40253274);用 于牙齿的治疗和牙科手术(参见US 2004/0115139);用于治疗神经肌肉疾病和状况(参见US 2002/0010138);用于治疗多种疾病和状况W及相关的疼痛(参见US 2004/0013692);用于 治疗由粘液分泌过多引起的状况例如哮喘和COPD(参见WO 00/10598); W及用于治疗非神 经元状况例如炎症、内分泌状况、外分泌状况、免疫状况、屯、血管状况、骨状况(参见WO 01/ 21213)。在此通过引用将所有上述出版物整体并入。
[0008] 预期无细胞毒性的蛋白酶例如梭菌毒素（例如BoNT和TeNT)在治疗性和化妆性治 疗人和其它哺乳动物中的用途将要扩大到范围日益宽广的能够受益于运些毒素性质的疾 病和不适。
[0009] 为了避免系统性的神经效果，许多梭菌毒素治疗利用向给定的祀位点（例如一种 祀组织)直接施用所述的梭菌毒素治疗剂。当W运种方式施用基于梭菌毒素的治疗剂时的 一个问题是毒素远离所述的施用位点而进入周围组织或系统性循环的传播。毒素远离祀组 织的扩散被认为对不受欢迎的副作用负责，运些副作用在极端情况下可能会是威胁生命 的。当W高的剂量、浓度和注射体积使用梭菌毒素治疗剂(例如BoNT治疗剂)时，运可能是一 个特别的关注。对于商业化的BoNT/A治疗剂，已经报道的与运个问题相关的副作用包括:无 力、广泛性肌肉虚弱、复视、下垂、吞咽困难、发声困难、构音困难、尿失禁和呼吸困难。吞咽 和呼吸困难可能是威胁生命的并且已经报道了与毒素效应的传播相关的死亡。
[0010] 因此，在本领域中存在对运样的梭菌毒素的需要:与已知的梭菌毒素相比，它在施 用位点具有增大的组织保留性质并且因此展示远离施用位点的扩散的减少。
[0011] 本发明通过提供工程化的梭菌毒素解决了上述问题，正如权利要求书中具体说明 的那样。
[0012] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个(例如至少 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1个)91单位。在一个实施方式中，所述的至少一个氨 基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.4个Pl单位。在一个实施方式中，所述的至少 一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个 氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.5个Pl单位。在一个实施方式中，所述 的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至 少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.6个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏 所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.8个Pl单位。在一个实 施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值 比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0013] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0014] 在某些实施方式中，所述工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 氨基酸修饰。
[0015] 在某些实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增 大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至 少2、3、4或5个Pl单位。
[0016] 本发明人已经发现，通过增大梭菌毒素的Pl，例如增大至少0.2个Pl单位或0.5个 Pl单位或1个Pl单位(通过向所述的梭菌毒素蛋白中引入至少一个氨基酸修饰），所得的工 程化的梭菌毒素有利地显示了增大的组织保留性质和减少的远离施用位点的扩散，同时保 留了祀细胞结合、易位W及祀SNARE蛋白切割的能力。因此，与缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素相比，所述的来自施用位点的梭菌毒素的传播被显著地减 少了。
[0017] 本发明所述的工程化的梭菌毒素适用于任何上述的治疗，并且与使用已知的梭菌 毒素治疗剂相比，可W有利地显示副作用的减少或不存在。
[0018] 本发明所述的工程化的梭菌毒素的增大的组织保留性质还提供增大的作用效力 和/或持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比，能够允许使用减少的剂量(或增大的 剂量而没有任何额外的副作用），从而提供了更多的优点。
[0019] 正如下面更详细地论述的那样，由所述的至少一个氨基酸修饰所提供的Pl的增大 意思是本发明的工程化的梭菌毒素在给定的抑下具有净电荷，该净电荷比缺乏所述的至少 一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素上的净电荷更正。不希望受任何一种理论限制， 本发明人相信，运种增大的正电荷允许本发明所述的工程化的梭菌毒素在施用位点处展示 更长的组织保留时间，运归因于在施用位点处，在所述工程化的梭菌毒素与阴离子细胞外 组分(例如细胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之间有利的静电相互作用。运些改善的静电相互作 用用于减少所述工程化的梭菌毒素远离所述施用位点的扩散，从而改善组织保留。
[0020] 举例来说，本发明所述的工程化的梭菌毒素的改善的组织保留性质可W允许（i) 更高的剂量进入个别的肌肉，例如胸锁乳突肌，不会传播到附近的颈部肌肉中而引起吞咽 困难，W及（ii)在单次治疗中更高的总剂量(对于所有的肌肉），不会传播到所述的循环中 而引起系统性的效应例如呼吸困难。对于患者的益处可W包括对大肌肉（例如所述的胸锁 乳突肌)的更有效的治疗，增大的在每次治疗期间注射几块不同的肌肉的机会，W及由于更 高的定量给药而导致的可能更长的有效治疗持续时间(再次治疗之前更长的持续时间是必 要的）。
[0021] 在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素在使用中具有正的净电荷(例如 当所述工程化的梭菌毒素在使用中位于组织中的所要施用位点时）。
[0022] 等电点（Pl)是一种给定的蛋白质的特性。正如本领域中熟知的那样，蛋白质是由 特定的氨基酸（当在一种蛋白质中时，也被称为氨基酸残基)序列制成的。20种氨基酸的标 准集合中的每一种氨基酸都具有不同的侧链(或R基团），意味着在一种蛋白质中，每一种氨 基酸残基显示不同的化学性质例如电荷和疏水性。运些性质可W受周围化学环境(例如溫 度和抑)的影响。一种蛋白质的总的化学特征将会取决于运些多种因素的总和。
[0023] 某些氨基酸残基（下面详述)具有能够电离的侧链，该侧链可能显示电荷，取决于 周围的抑。在给定的抑下，运样的侧链是否带电取决于相关的能够电离的部分的地a,其中 PKa是所述酸的一个指定质子从一个共辆碱分离的解离常数化a)的负对数。
[0024] 例如酸性的残基例如天冬氨酸和谷氨酸具有地a值大约为4.1(精确的地a值可能 取决于溫度、离子强度和所述能够电离的基团的微环境）的侧链簇酸基团。因此，运些侧链 在7.4的pH下(经常被称为"生理抑")展示负的电荷。在低抑值下，运些侧链将会变成质子化 的并且失去它们的电荷。
[0025] 相反地，碱性的残基例如赖氨酸和精氨酸具有地a值大约为10-12的含氮的侧链基 团。运些侧链因此在7.4的抑下展示正的电荷。在高pH值下，运些侧链将会变成去质子化的 并且失去它们的电荷。
[0026] 因此，蛋白质分子的总的（净）电荷取决于存在于所述蛋白质中的酸性残基和碱性 残基的数目（W及它们的表面暴露程度)和环境的pH。改变环境的pH，就改变了所述蛋白质 上的总的电荷。因此，对于每一种蛋白质，存在着一个给定的抑，在该pH下正电荷和负电荷 的数目是相等的并且所述蛋白质显示总体上无净电荷。已知运个点与等电点（Pl)-样。等 电点是蛋白质生物化学中的一个标准的概念，技术人员将会对它很熟悉。
[0027] 因此，等电点(Pl)被定义为一种蛋白质显示零净电荷时的抑值。Pl的增大意味着 所述蛋白质展示零净电荷需要更高的pH值。因此，Pl的增大表示在给定的抑下，一种蛋白质 的净正电荷的增大。相反地，Pl的减小意味着所述蛋白质展示零净电荷需要更低的pH值。因 此，PI的减小表示在给定的抑下，一种蛋白质的净正电荷的减小。
[0028] 在本领域中测定一种蛋白质的Pl的方法是已知的并且对于技术人员来说将会是 熟悉的。举例来说，从存在于所述蛋白质中的每一种氨基酸的平均地a值能够把蛋白质的Pl 计算出来。备选地，使用等电点聚焦技术能够把一种蛋白质的Pl实验测定出来。运种技术根 据蛋白质的Pl使用电泳来分离它们。典型地使用一种具有固定化pH梯度的凝胶来进行等电 点聚焦。当应用电场时，所述蛋白质迁移穿过所述的抑梯度，直到它达到它具有零净电荷时 的抑，运个点就是所述蛋白质的PI。
[0029] 通过改变显示在蛋白质表面上的碱性基团和/或酸性基团的数目，可W增大或减 小一种蛋白质的pl。运能够通过修饰所述蛋白质的一个或更多个氨基酸来实现。例如可W 通过减少酸性残基的数目或通过增大碱性残基的数目来提供Pl的增大。下面更详细地讨论 运样的氨基酸修饰。
[0030] 天然(未修饰的)梭菌毒素具有大约5-6的pi。因此，在7.4的抑下，天然肉毒杆菌毒 素具有负净电荷。举例来说，BoNT/A的Pl是6.4，并且BoNT/A分子在7.4的抑下具有-8的净电 荷。如上所述计算出了运些Pl值。
[0031] 表1:
[0033] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个Pl 单位。
[0034] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大0.2个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下 文中将会是Pl从6.4增大到6.6。
[0035] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单 位。
[0036] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大1个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下文 中将会是Pl从6.4增大到7.4。
[0037] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高至少2个Pl单位。
[0038] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高2至5个Pl单位。
[0039] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为6(例如至少6、至少7、至少 8或至少9)的pi。
[0040] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为7的pi。
[0041] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有6至10的Pl(例如7至9的Pl或8至9 的 pl)。
[0042] 如上所述，本发明的所述工程化的梭菌毒素具有增大的组织保留性质，该性质也 提供增大的效力和/或作用持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比能够允许减少使 用的剂量(或者允许增大的剂量而没有任何额外的效应）。其中可W定义运些有利的性质 (它们代表治疗指数的增大）的一种方式是根据所述工程化的梭菌毒素的安全比。在运个方 面，通过测量一种相关的动物模型中体重减少的百分数(例如一种小鼠，其中体重减少是在 7天的施用内检测的），能够从实验上估计梭菌毒素的不受欢迎的效应（由所述毒素远离所 述施用位点的扩散引起的）。相反地，通过趾外展评分(DAS)分析一一一种肌肉擁痕量度，能 够从实验上估计梭菌毒素的理想的中祀效应。可W通过把20化配制在明胶憐酸缓冲液中的 梭菌毒素注射到小鼠脾肠肌/比目鱼肌复合体中，然后通过使用Aoki的方法估计趾外展评 分(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820:2001)来进行所述的DAS分析。在所述的DAS分析中，通 过尾部短暂地悬挂小鼠 W便引出一种特征性的吃惊反应，其中所述的小鼠伸展它的后肢并 且外展它的后趾。在注射梭菌毒素后，按照五点评分尺度(0 =正常至4 =趾外展和腿伸展减 少最大)对不同程度的趾外展进行打分。
[0043] 然后可W把一种梭菌毒素的安全比表示成在体重下降10%所需的毒素的量(在小 鼠中定量给药后第一个7天内在峰值效应下测得的）与DAS得分为2所需的毒素的量之间的 比率。因此，高安全比得分是理想的，并且指示一种能够有效地使一种祀肌肉擁痕并且具有 微小的不希望的脱祀效应的毒素。本发明的工程化的毒素具有的安全比高于对等的未修饰 的(天然）肉毒杆菌毒素具有的安全比。
[0044] 因此在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为8(例如至少8、9、 10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比是运样计算的：体重变化-10%所需 的毒素的剂量(pg/小鼠）除WDASEDso(pg/小鼠）[抓50 =产生一个为2的DAS得分所需的剂 量]。
[004引在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为10的安全比。在一个 实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为15的安全比。
[0046] 本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰。所述的至少一个氨基酸修 饰增大所述梭菌毒素的Pl，如上所述。在本发明的上下文中，一种氨基酸修饰是一种梭菌毒 素的氨基酸序列的修饰。运样的一种修饰可W通过把所述序列中的一个氨基酸替换为另一 个氨基酸（即取代）、通过把一个新的氨基酸插入所述的序列中或者通过缺失所述序列的一 个氨基酸来实施。被插入蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸也被称为氨基酸残基。
[0047] 在蛋白质中发现的20种标准氨基酸如下所示：
[004引 表2:
[0049]
[0051 ]下列氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸（负的）、谷氨酸（负的）、精氨酸 (正的）和赖氨酸(正的）。
[00划在7.4的抑下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷，同时精 氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性的 氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性的氨基酸残基。
[0053] 下列氨基酸被认为是不带电荷的极性的（意思是它们能够参与氨键结合)氨基酸： 天冬酷胺、谷氨酷胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
[0054] 下列氨基酸被认为是不带电荷的疏水的氨基酸：丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
[0055] 通过向梭菌毒素中引入一个或更多个增大所述梭菌毒素中正电荷与负电荷的比 率的氨基酸修饰，能够实现所述的梭菌毒素的Pl的增大。
[0056] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰选自：氨基酸替换、氨基酸插入和 氨基酸缺失。
[0057] 在一种氨基酸替换中，形成所述梭菌毒素氨基酸序列的一部分的一个氨基酸残基 被一个不同的氨基酸残基所替代。所述的替代氨基酸残基可W是如上所述的20种标准氨基 酸中的一种。
[0058] 备选地，在一种氨基酸替换中，所述的替代氨基酸可W是一种非标准氨基酸(不是 上述20种氨基酸的标准组的一部分的一种氨基酸）。举例来说，所述的替代氨基酸可W是一 种碱性的非标准氨基酸，例如心鸟氨酸、L-2-氨基-3-脈基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸 的D-异构体）。把非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域中已知的，并且包括使用大肠 杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
[0059] 在一种氨基酸插入中，把另外一个氨基酸残基(正常不存在的一个氨基酸)渗入所 述的梭菌毒素的氨基酸序列中，从而增大了所述的序列中氨基酸残基的总