一种基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物止血复合材料，具体涉及一种基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料，及其具体制备方法。
【背景技术】
[0002]壳聚糖是一种来源于虾、蟹壳的天然有机高分子多糖，来源丰富，价格低廉。据初步统计，全世界每年由生物中提取壳聚糖20亿吨以上，可以说壳聚糖是自然界中仅次于纤维素的取之不尽、用之不竭的第二大天然生物有机资源。在其功能方面，天然壳聚糖具有促进组织再生、抑菌、抗真菌生长的特性。壳聚糖的无毒，可生物降解，与生物组织兼容性好以及促进伤口愈合的性质赋予它用作止血材料的良好性能。推测其止血机理为:壳聚糖使红细胞表面与其发生交联而使红细胞粘附；或者是壳聚糖在血液中发生某种聚合反应，形成立体网状结构，捕获红细胞而使其聚合，从而形成血栓止血。研究发现壳聚糖在适当条件下其分子可相互交联，在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解，形成水凝胶。
[0003]另一方面，提取自海洋贻贝的贻贝粘蛋白作为一类广谱性生物粘合蛋白近年来也收到广泛关注。其特点是具有尚强度、尚初性和防水性。赌贝粘蛋白强度极尚的粘附性与其特殊的分子结构、分子内多巴(D0PA)介导的链间交联和与基底之间的相互作用方式有关。D0PA分子中的酚基的氧化以及由此所介导的D0PA分子与外界固体表面之间形成的共价/非共价键合耦联，这些作用力致使贻贝粘蛋白可以很好的粘附在创口上。同时，贻贝粘附蛋白是一系列碱性蛋白质，在生理pH条件下带有大量正电荷。当带有正电荷的贻贝粘蛋白与带有负电荷的血液细胞接触，即会因静电作用促进血液细胞的团聚，起到一定的止血效果，同时因相同的作用机理促进创口表皮细胞的爬行生长，加快创口结痂愈合的速度。并且，贻贝粘蛋白还具有很好的生物相容性和可降解性、防水且无毒性，是一类极具优势和潜力的生物胶黏剂，因此在软组织粘接、人造骨骼、断骨接合、口腔修复、外科手术止血等领域具有广泛的应用前景。
[0004]中国专利CN103087976A公开了一种促进细胞贴壁生长的材料，包括用于细胞培养的固体基质和贴附于该固体基质上的贻贝粘蛋白。
[0005]中国专利CN103520766A公开了一种贻贝粘蛋白液体产品、其制备方法及其应用，形成的产品可以用作创面修复产品、创面保护产品、医药生物粘合剂产品、医用涂层产品、工业涂层产品、生化试剂产品等。
[0006]中国专利CN103638554A公开了一种丝素蛋白与海洋贻贝粘附蛋白复合材料。
[0007]利用壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料及其制备方法未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种工艺简单、使用方便、能应用于多种不同部位的止血复合材料。为达到上述目的，本发明提供了一种基于壳聚糖与贻贝粘蛋白的止血复合材料及其具体制备方法。当壳聚糖水凝胶与海洋贻贝粘蛋白存在于同一体系时，贻贝粘蛋白在增强壳聚糖水凝胶力学性能的同时可提高其对创口的粘附能力。两种具有止血效果的生物材料相辅相成，得到一种生物相容性强可降解的止血复合材料。
[0009]本发明的基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料包括壳聚糖类水凝胶载体及引入到壳聚糖类水凝胶载体中的海洋贻贝粘蛋白。壳聚糖水凝胶包括温度敏感性、pH敏感型、温度/pH双重敏感型。具体而言，所述壳聚糖水凝胶包括壳聚糖及其衍生物与甘油磷酸钠凝胶，壳聚糖衍生物凝胶(例如羟丁基壳聚糖)，壳聚糖接枝凝胶例如聚乙二醇接枝壳聚糖、聚异丙基丙烯酰胺接枝壳聚糖、泊洛沙姆接枝壳聚糖凝胶等，壳聚糖与其他高分子共混凝胶例如壳聚糖与聚乙烯醇共混物温度敏感型物理凝胶、壳聚糖与甲基纤维素共混物温度敏感型物理凝胶等。海洋贻贝粘蛋白在壳聚糖类水凝胶载体中的引入量优选为1?500mg/cm3水凝胶，优选 10 ?100mg/cm3，更优选 20 ?50mg/cm3。
[0010]在一个优选的方案中，所述壳聚糖水凝胶为温度敏感型水凝胶。
[0011 ] 在一个进一步优选的方案中，所述壳聚糖水凝胶为壳聚糖/ β -甘油磷酸钠水凝胶体系。壳聚糖/β-甘油磷酸钠(β-GP)混合液能够在低温保持液态，温度升高到体温时转变为凝胶。其中，壳聚糖分子量优选为200000?600000，其优选作为稀酸溶液使用，浓度为例如l-10wt %，优选为1 % -4wt %, β~甘油磷酸钠优选作为在水中的溶液使用，溶液浓度优选为40?70 %，优选50 % -60 %。壳聚糖的稀酸溶液与β -甘油磷酸钠水溶液的重量比优选为8?15:1?5，优选9?12:2?3。
[0012]体系中存在的贻贝粘蛋白是提取自海洋紫贻贝的Mefp-Ι?Mefp-6六种蛋白的混合物，或商品化的BD Cell-Tak?(Mefp-U Mefp-2混合物)，或利用基因重组获取自工程菌的Mefp-5单一蛋白溶液。贻贝粘蛋白溶液的浓度优选为0.5?10mg/mL，更优选2-6mg/mL。
[0013]在一个优选的实施方案中，海洋贻贝粘蛋白可在壳聚糖成胶过程中添加，或者将脱水后的壳聚糖凝胶置于贻贝粘蛋白溶液中，通过吸附来引入。
[0014]根据本发明的第二个方面，提供上述基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料的制备方法，该方法包括:先用稀酸配制壳聚糖溶液，例如l_10wt%，优选1-4?〖％的壳聚糖的溶液，稀酸例如为稀盐酸或稀醋酸(例如0.05?0.2M)，并向其中加入贻贝粘蛋白溶液(优选0.5?10mg/mL，更优选2_6mg/mL)，配制β -甘油磷酸钠溶液(优选50% -60%β -甘油磷酸钠溶液)，分别冰浴冷却，按照7:1-9:1的比例混合以上两种溶液，形成凝胶。此时可选择两种方式成胶。可将以上所述混合溶液置于出血处，溶液在体温下3-5min后自动成胶，可达到止血目的。也可将上述溶液置于35°C _40°C水浴中搅拌均匀，5-8min后即可得到壳聚糖水凝胶，敷于出血处也能达到相同目的。上述稀酸优选为食品级酸，优先选自稀盐酸、稀醋酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、山梨酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸等中的一种或多种。
[0015]根据本发明的第二个方面的另一个实施方案，上述基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料的制备方法包括:先用稀酸配制壳聚糖溶液(例如l_10wt%，优选l-4wt%的壳聚糖溶液)；配制甘油磷酸钠溶液(例如40?65wt%水溶液，优选50wt%-60wt%水溶液)，分别冰浴冷却，按照7:1-9:1的比例混合以上两种溶液，置于35°C -40°C水浴中搅拌均匀，静置后即可得到壳聚糖水凝胶；将壳聚糖水凝胶置于无水乙醇中脱水(例如5-10min)，脱水产物置于0.5?10mg/mL(优选2_6mg/mL)贻贝粘蛋白溶液中，恢复凝胶态后即得壳聚糖水凝胶止血复合材料。上述稀酸优选为食品级酸，优先选自稀盐酸、稀醋酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、山梨酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸等中的一种或多种。
[0016]根据本发明的第三个方面，提供了上述基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料或通过上述方法制备的基于壳聚糖与海洋贻贝粘蛋白的止血复合材料用于制备止血产品的用途。
[0017]本发明具有以下有益效果:
[0018]1)本发明首次将贻贝粘蛋白与壳聚糖水凝胶共同运用到创面止血中，得到一种新型止血效果优异的止血复合材料。
[0019]2)本发明所述水凝胶质地柔软，敷贴性强，可用于体表创口止血，也可用于体内组织、器官等部位出血。
[0020]3)本发明所得止血复合材料具有免疫原性低、可生物降解的优点，使用后无需移除，因此可用于体内止血。
[0021]4)本发明方法具备工艺简单，易操作的特点，应用范围广。
【附图说明】
[0022]图1为三种壳聚糖水凝胶复合止血材料的照片，由左向右依次为:新鲜制备的壳聚糖水凝胶复合止血材料、部分脱水后的壳聚糖凝胶复合止血材料