用于治疗中枢神经系统疾病的含有低浓度唾液酸的重组人红细胞生成素的鼻用制剂的利记博彩app
【专利说明】用于治疗中枢神经系统疾病的含有低浓度唾液酸的重组人红 细胞生成素的鼻用制剂
[00011 本申请是申请号为200680034781.X、申请日为2006年7月27日、发明名称为"用于 治疗中枢神经系统疾病的含有低浓度唾液酸的重组人红细胞生成素的鼻用制剂"的发明专 利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物制药工业，特别涉及含有低含量(碱性)唾液酸的rhEPO鼻内药物 的制备，其通过遗传工程开始于中国仓鼠卵巢细胞，用于治疗脑血管、神经变性和精神病学 疾病。
【背景技术】
[0003] 促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，其分子量在34kDa范围内；该蛋白质部 分由大约166个氨基酸组成;它产生于肾、肝脏和中枢神经系统的细胞中，并且它参与红细 胞和其它造血细胞的增殖、分化和成熟。
[0004] 1998年，Sakanaka和合作者报告了在沙土鼠的颈总动脉阻塞(一个全球性的缺血 模型），接着将rhEPO注入侧脑室后，rhEPO对抗体内缺血损伤的神经元保护特性。那些作者 观察到对CA 1海马神经元的缺血性损伤的减少。
[0005] rhEPO的神经元保护作用可能归于不同的因素，包括：拮抗谷氨酸诱导的细胞毒 性、增加抗氧化性酶的表达、减少自由基介导的一氧化氮(NO)的形成、使脑血流正常化、影 响神经递质的释放、促进新血管发生、抑制兴奋性毒素或一氧化氮诱导的细胞凋亡、增加抗 细胞凋亡基因的表达、神经营养作用、降低神经元兴奋性、脑抗炎作用、抑制kainato诱导的 细胞凋亡和促炎性细胞因子的产生、血管原性和神经原性作用。此外，rhEPO有助于缺血预 调节。整体而言，这些原因可以证明rhEPO在治疗脑血管、神经变性、精神病学疾病中的应 用。
[0006] rhEPO的神经元保护特性能预防神经元死亡或使神经元死亡复原，神经元死亡成 为许多中枢神经系统疾病，例如缺血、神经性创伤和神经变性和神经元炎性疾病的特征性 事件。
[0007] 还描述了神经变性过程促使触发精神分裂症的生理病理学。这就是为什么神经元 保护性药物可以是治疗该疾病的有效替代治疗。
[0008] -旦将生物暴露于某些病理学条件，例如低血糖症或强烈的神经元去极化，或由 于线粒体产生氧一反应性物种，rhEPO的表达显著增加。
[0009] 另一方面，炎症过程通过不同的机理增加脑损伤，并且它们甚至直接局部抑制EPO 的产生。事实上，即使在脑缺血后内源性产生rhEPO,其表达也显著地受到炎性细胞因子的 抑制。该抑制降低了 rhEPO的神经元保护能力并证明了 rhEPO的外源性施用对脑血管、神经 变性或精神病学疾病特别有益。
[0010] 此外，众所周知，rhEPO分子对其受体(receiver)的亲和力（并且，因此，对该分子 的生理学反应的有效性)与和它结合的唾液酸百分比反相关。
[0011] 通过静脉内途径对脑缺血的鼠模型施用，rhEPO的神经元保护作用[LM Brines and cols,PNAS97( 19) :10526-10531,2000]减少了由缺血引起的损伤50%到75%，并且在 人类中产生类似的效果(W0 0354475)。然而，使用酸性重组人促红细胞生成素(rhEPO)的临 床和实验结果还没有评估使用该分子对诱导红细胞生成的潜在负性中期影响，因为已知血 脑屏障（BBB)的低渗透性和CNS中rhEPO受体的低亲和性，为了相对长时间获得有效的药理 学效果，需要相对大量的rhEPO。在这些条件下，人们冒增加血液粘度和增加溶血栓事件(其 导致大脑缺血）的可能性的风险。已经报道了应用酸性rhEPO的这些负性结果是用该分子治 疗的肾炎患者中的并发症。
[0012] 为了开发出增加 BBB渗透性(其被认为是将物质结合至脑组织中的关键步骤)的方 法，已经进行了研究（US 5260308;TO 8901343;US 4801575;US 5442043;JP 57146710和JP 01149718)。这些方法中的许多方法包括形成肽的缀合物的所谓的载体(US 5442043)，或它 们使用嵌合肽(US 48015575)来将物质结合到脑。已经报道过包含促红细胞生成素的脂质 体的制剂（JP 08231417)。已报道了关于神经节苷脂的使用鼻内途径使分子达到CNS(US 4639437)，以及关于神经元治疗药通过鼻粘膜对它们的吸收并随后通过神经嗅觉途径将它 们输送到达脑(EP 504263)。
[0013] 存在几个涉及rhEPO液体制剂保护的专利，下面列出其中最具有代表性的专利： [0014]液体制剂，其中使用的有效成分是rhEPO并且其中在任何情况下，蛋白质以可注射 的形式提供（例如：CIP0-2041989;CIP0-2353553)。这种给药方式表明使用的rhEPO为酸类 型，就是说，超过40%的分子为唾液酸所覆盖，否则它将被肝脏酶灭活，并且它在临床上不 会有效。
[0015] 专利CIP0-2074820使用鼻内途径来施用蛋白质。在该情况下，环糊精用作制剂的 成分，并且同样追求rhEPO的全身性吸收，以至于蛋白质也是酸性的。
[0016] 存在涉及使用生物粘附剂增加蛋白质在鼻腔内的停留时间的科学出版物 Polireddy D和cols，[International Journal of Pharmaceutics(127):115-133,1996]； 然而，没有关于在含有rhEPO的制剂中使用生物粘附剂的报道。
[0017] 专利CIP0-2353553证明了外源性施用rhEPO用于治疗大脑缺血，但与以前的情况 完全一样，该研究是蛋白质直接或者间有效地进入血流以便有效，以至于我们同样地在存 在含有高含量唾液酸的rhEPO。
[0018] 专利CIP0-2408685覆盖了rhEPO的不同制剂，但在这种情况下，打算让它们用于治 疗贫血，所以它是酸性rhEPO,因为碱性rhEPO不能促进红细胞的增殖、分化和成熟。
[0019] 专利CIP0-2437333详细说明了保护的制剂是起源于α促红细胞生成素，也就是起 源于酸性rhEPO。
[0020] 在以前披露和文献中修订的所有情况中，提到的是酸性rhEPO,而我们正在申请的 专利打算保护起源于碱性rhEPO的液体制剂。
【发明内容】
[0021 ]在rhEPO的生产过程中，获得有不同含量唾液酸的糖蛋白。小于40%的其分子被 (碱性)唾液酸保护的蛋白质正常被清除，因为它通过全身途径而不具有生物学活性。含有 低含量唾液酸的这种碱性rhEPO代表了全部产生的rhEPO的70%。令人意外地是，我们已发 现鼻内施用碱性rhEPO能够比酸性rhEPO具有更高的治疗价值;本发明的结果使得能利用 rhEPO的碱性同工型，其当时没有被回收而且容易获得。这代表了很大的经济优势，因为它 允许回收在当时组成rhEPO生产的废物。
[0022]在初级卫生保健系统水平，在能走的基础上，该制剂可以用来治疗和/或预防中枢 神经系统疾病，包括脑血管，神经变性和精神疾病。建议的溶液的优势包括使用具有低含量 唾液酸的rhEPO用于允许在较小剂量下有更大保护作用的治疗目标。实现了治疗药快速到 达作用部位，而这对在存在脑缺氧的情况下，获得满意的治疗效果是关键的。在脑血管疾病 的特殊情况下，在级联缺血的一些过程发生之前，在急性期从治疗干预开始是必要的。这称 为治疗窗口期。
[0023]鼻内施用碱性rhEPO消除了诱导红细胞生成的危险。红细胞浓度的增加将增加血 液粘度，从而使阻塞或出血事件后再灌注危险，以至于脑血流将减少并因此将阻碍氧和养 分到达脑组织。
[0024] 鼻内途径比其它施用形式有更大的优势，允许快速到达脑；它比静脉内或脑室内 途径的侵入性更小，并且一定百分比的rhEPO能到达脑脊液而不必首先传到血流，这避免首 过肝脏步骤代谢，从而防止了它随后失活。鼻内应用不是创伤性的并且消除了外科手术危 险和其它由创伤性途径产生的可能并发症。它构成了在不损害BBB的条件下到达脑的可替 代性途径。使用血管途径的可替代性的施用途径保证了分子经通过组织液的扩散，到达中 枢神经系统的很少或无血液灌注的区域。
[0025] 考虑到鼻内施用的主要限制之一是快速纤毛-诱导的粘液清除，本发明采取了使 用生物粘附性聚合物的策略，该生物粘附性聚合物增加了rhEPO在鼻腔内的停留时间。在制 剂的开发过程中，为了获得具有物理、化学和微生物学稳定性(该稳定性自始至终保持其治 疗特性）的制剂，也混合了其它的辅助性物质或赋形剂，例如防腐剂、张力活性剂、pH调节 剂、等渗剂和蛋白质稳定剂，所述自始至终保持其治疗特性。
[0026] 使用的rhEPO在其分子中包含小于40%的唾液酸(就是碱性rhEPO)，其浓度在0.5 到2mg/mL的范围内。因此，提供的制剂为液体、无色、透明制剂，无机械杂质，表观粘度在10 至lj250mPas的范围内。使用了浓度0.4到0.9%的羟丙基甲基纤维素(HPMC)，0.2到0.8 %的羟 丙基纤维素(HPC)，0.25到0.5%的甲基纤维素(MC)作为生物粘附性聚合物。
[0027]主要