富含血小板和/或生长因子并具有凝胶型蛋白质的血液组合物的制剂及其制备方法
【专利说明】
[0001 ] 说明书
技术领域
[0002]本发明涉及具有希望的生物学或医学性质的制剂，该制剂获自富含血小板和/或富含生长因子的初始血液组合物。本发明还涉及制备所述制剂的方法。
现有技术
[0003]现有技术已描述来自人和动物血液的组合物的制备，其中将血液以得到呈现有用的生物学和医学性质的富含血小板的血浆(PRP)和/或富含生长因子的血浆(PRGF)的方式进行处理。已成功将所述PRP或PRGF用于离体应用，例如作为细胞培养基，以及体内应用，例如用于完成患者的骨再生过程或者通过渗入用于治疗患关节疼痛的患者。在将所述组合物要用于体内应用以治疗患者的情况中，制备PRP和PRGF制剂的技术已朝向自体组合物的制备即从患者自身的血液得到的组合物发展。所述类型组合物和制备方法的示例可见于专利US6569204和ES2221770中。
[0004]在最近几年，技术已经发展，目的在于保证可以以盖伦(galenic)组合物或药物制剂的形式得到富含血小板和/或生长因子的组合物。将盖伦组合物或药物制剂理解为使无论化学或生物来源(如采用PRP或PRGF中的蛋白质的情况)的药物或主要活性成分适合个体化供应，以便于其施用。药物的盖伦组合物或药物制剂是特别重要的，因为其决定药物的有效性和安全性，因为其控制药的剂量和药物分子向组织的递送。此外，药物的盖伦组合物或药物制剂是保证药物的制备、其剂量及其施用是已知的、受控的，并能相对容易和以可重复方式实行的决定性因素。简言之，盖伦组合物或药物制剂寻求便于处理、保存、运输、施用，并就整体而言，用于治疗目的的任何药物或物质的性质。
[0005]最广泛应用的PRP或PRGF药物制剂之一已知为纤维蛋白凝胶或纤维蛋白筛，其是在某些应用中非常有用的具有半固体状稠度的制剂。制备纤维蛋白凝胶或筛的方法通常开始于第一阶段，其中利用适用方法得到PRP或PRGF，例如通过将从患者提取的血液离心，直至血液分成不同级分(fract1n)，并提取顶部级分即富含血小板的血浆(PRP)和富含生长因子的血浆(PRGF)的级分。然后，将PRP或PRGF中所含的血小板活化(活化应理解为使血小板释放其内部所含一些生长因子的行动)，例如通过加入氯化钙来活性。由于活化，并假如允许经过足够量的时间，来自血浆中包含的纤维蛋白原的纤维最终发生聚合，由此产生构成纤维蛋白凝块的最终化合物(其还称作纤维蛋白凝胶或筛，这是因为其半固体稠度，像一种类型的生物海绵)。为了从用抗凝剂例如用柠檬酸钠改性的血液中得到纤维蛋白凝胶，这是是通常完成的过程。还可以在不将其先与抗凝剂混合的情况下，将血液进行处理。在这一情况下，当将血液离心时，不需加入氯化钙或任何其他血小板活化剂，将血浆与血红细胞分离，并得到纤维蛋白凝胶。可将纤维蛋白凝胶或筛用于例如下述应用中:以形成填充骨质缺损的生物支架；以施用至伤口或外伤，用于逐步释放生长因子；以用作基质，用于干细胞的培养；以用作密封缺损或溃疡的膜；以及其用于组织的生产，这是组织工程学已知的，其中除细胞和生长因子之外，具有细胞可在其上面生长的基质或支架是尤其重要的。
[0006]纤维蛋白凝胶或筛具有一些显著的局限。纤维蛋白凝胶或筛的主要限制是其是不稳定的并趋向于收缩的事实。因此，纤维蛋白凝胶或筛不能随时间推移维持稳定体积或者不能随时间推移提供稳定的组织支持。尽管在一些应用中，所述收缩的趋向性可能是需要的，但是在其他应用中，是不需要的。例如，作为窦底提升已知的牙外科技术中，用于再生骨质缺损的生物材料必须具有骨传导性，并且其还必须能长期维持物理空间，直到骨基质形成；否则，空间会倒塌，不利地影响牙槽骨的垂直再生。另一个示例是胸腺切除(乳房切除术)的实例，其中用于填充乳腺空间的生物材料或凝胶必须提供适当的机械阻力，并长期提供空间和体积，以保证所述空间不塌陷。另一个示例是填充剂或化妆品填充剂(例如透明质酸)的实例，其是广泛用于美学领域的填充物质(提供和维持体积)，以增加角落和皱折的体积，并矫正所述缺陷，提供更年轻的外观;设计为作为填充剂或填充物质的任何物质必须是机械稳定的，并抵抗压缩，以便其能维持组织的体积。此外，纤维蛋白凝胶或筛的收缩趋势阻碍并甚至阻止凝胶或筛作为释放另外的外部物质、药物、蛋白质等物质的应用。
[0007]纤维蛋白凝胶或筛的另外限制是其不能以其正常、半固体状态渗入或插管引入，这阻止其作为填充剂施用在皮肤上、用于皮肤-化妆品、创伤学和其他领域例如生物学或药物领域。
[0008]本发明的目的是提供具有希望的生物学或医学性质、自富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物得到的制剂，且该制剂不趋向于收缩，由此随时间推移维持稳定体积。其他应用中，在其中稳定组合物是需要的一些应用中，所述制剂提供纤维蛋白凝胶或筛的替代是合乎需要的。
[0009]发明简述
[0010]本发明涉及具有希望的生物学或医学性质的制剂，其包含或衍生自富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物(人或动物来源的；自体的、同源的或异源的)，且其包含来源于初始血液组合物的蛋白质。该制剂提供所述蛋白质由于加热和冷却处理导致的胶凝状态的独特性质。具体地讲，胶凝蛋白质优选是白蛋白、糖蛋白、球蛋白和/或纤维蛋白原。本发明的制剂可描述为“蛋白质凝胶”(使用用于指纤维蛋白凝胶的类似术语)，因为其提供胶凝状态蛋白质提供的凝胶样稠度。所述制剂是可变形的。与其它填充凝胶、其它富含血小板和/或生长因子的血液组合物，以及现有技术已知的其它类似组合物相比，本组合物提供新的形态学和生物力学结构。
[0011]还提供用于制备上述制剂的方法，该方法包含下述步骤:得到富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物，其基础配方可以变化;将所述初始血液组合物在60°c-100°c的温度下加热至少一分钟；将初始血液组合物冷却至少一分钟。可视作热序列的本发明方法为富含血小板和/或生长因子的血液组合物提供体积和刚性，产生蛋白质凝胶或具有凝胶稠度的制剂，其归因于初始血液组合物中所含的一些蛋白质的胶凝状态。
[0012]本发明的制剂是生物相容的、可生物降解的，并呈现由存在的血小板或生长因子提供的希望的生物学或医学性质。此外，由于初始血液组合物中所含的一些蛋白质的胶凝状态，其还具有稠密或粘稠的稠度，所述稠密或粘稠的稠度随时间推移是稳定的。因此，本发明制剂是纤维蛋白凝胶或筛的有利替代物，这是由于该制剂不收缩并由此保持物理空间被填充的事实。此外，所述制剂提供对压缩的良好耐受，与透明质酸(通常用作填充剂或填充物质)类似或比透明质酸更好，并令人满意地经受住组织可能施加的抵抗力。因此，所述制剂是高度适合于用作填充剂或填充物质的。此外，即使当纤维蛋白筛和本发明制剂本质上都是半固体时，仅后者可以是被渗入或被注入的，这归因于其可变形的事实。本制剂的另一个优点是可将其干燥，并在以后再水合。
[0013]附图简述
[0014]本发明的详述可见于所附的非限制性附图:
[0015]-图1显示根据本发明的示例性制剂的两个电子显微图像。
[0016]-图2显示根据本发明的另一个示例性制剂的两个电子显微图像。
[0017]-图3显示由以不同温度和时间处理的纤维蛋白凝块制备的根据本发明的各制剂的溶胀因子。
[0018]-图4显示通过在不同温度和时间处理上清液而制备的根据本发明的各制剂的溶胀因子。
[0019]-图5显示根据本发明的各制剂的骨细胞相容性结果，其是用MG63成骨细胞样细胞系测试的。
[0020]-图6显示根据本发明的各制剂的其它骨细胞相容性结果，其是用MG63成骨细胞样细胞系测试的。
[0021]-图7和8分别显示根据本发明的12种制剂中血小板-衍生生长因子(PDGF-AB)和β转化生长因子(TGF-β)的含量。
[0022]-图9显示在孵育不同时间的四种本发明制剂中PDGF-AB生长因子的释放动力学。
[0023]-图10显示当孵育两天时，根据本发明的四种制剂的TGF-β生长因子的释放动力学。
[0024]-图11显示已注射根据本发明的四种制剂样品的实验室大鼠的背部照片。
[0025]-图12显示与前一附图的测试相关的图片，其显示注射后两周测量的在真皮内水平注射制剂后半椭球的体积。
[0026]本发明详述
[0027]为了克服与纤维蛋白凝胶和筛状物缺乏稳定性相关的现有技术中存在的问题，提出具有希望的生物或医学性质且具有随时间推移的提高的稳定性的替代制剂。所述制剂包含或衍生自初始血液组合物。血液组合物富含血小板和/或生长因子，并还包含各种蛋白质。因此，所述制剂还富含血小板和/或生长因子，并包含各种蛋白质。所述蛋白质中，存在一些胶凝状态的蛋白质，这旨在说所述蛋白质是变性的，并形成组织化的蛋白质的网状系统，这优选归因于热处理和冷却处理。胶凝状态的蛋白质优选是白蛋白、糖蛋白、球蛋白和/或纤维蛋白原。还已证实根据本发明的蛋白质凝胶不收缩，可容易地插管引入或渗入，并保持体积和空间，不同于仅基于纤维蛋白网状系统的其它凝胶。
[0028]初始血液组合物可例如是富含血小板的血浆，即具有高浓度血小板的血浆。通常，利用血液离心技术(以将血液分成血红细胞级分、白血细胞级分和富含血小板的血浆(PRP)的级分)，得到所述血浆，随后进行分离全部或部分富含血小板的血浆(PRP)的级分的步骤。
[0029]初始血液组合物还可以是富含血小板