聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及新的生物制品冻干制剂、制备方法及在相关治疗领域的应用，具体地 说，本发明设及给予由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的聚乙二醇化的重组产航假丝 酵母尿酸氧化酶冻干注射剂。
【背景技术】
[0002] 尿酸是鸟类、爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嚷岭代谢的终产物，因为在 运些动物体内缺乏W分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素、二氧化碳和双氧水的尿 酸氧化酶。尿酸作为人体嚷岭代谢的终产物经肾脏排泄，当尿酸生成超过肾脏代谢时，例如 富嚷岭食物摄入过多W及白血病和淋己瘤及其化疗过程所引起的嚷岭代谢增加或者当肾 脏处理病理状态时使正常产生的尿酸排泄受阻，运两种状况都会造成血浆尿酸显著升高， 形成高尿酸血症。由于尿素及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会 引发或加剧很多疾病，例如：持续高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节、滑膜引起的急性 炎症和疼痛是痛风的主要病因；尿酸不仅可W刺激血管平滑肌细胞增殖，而且还导致内皮 细胞功能障碍；血浆高尿酸也是动脉粥样硬化等屯、血管疾病的重要危险因素；尿酸沉积在 肾脏组织，是引发急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾炎的主要原因。
[0003] 降尿酸的经典方案是用别嚷岭醇等黄嚷岭氧化酶抑制剂类药物降低尿酸生成，或 用丙横舒、苯漠马龙等药物促进尿酸排泄。黄嚷岭的水溶性低于尿酸，其积累有潜在的危 险，黄嚷岭氧化酶抑制剂在初始尿酸浓度太高时疗效很差，还能引发超敏综合征，表现为发 热、毒性上皮细胞坏死溶解、肝炎和嗜酸细胞增高，死亡率达20%，另外运类药和丙横舒、苯 漠马龙等促尿酸排泄类药都有明显肝肾毒性。因此，经典的降尿酸治疗策略不够安全而且 疗效也不够理想。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄能力使尿酸氧化酶成为 治疗高尿酸血症及其继发症的理想药物：临床研究表明尿酸氧化酶可快速高效降低血清尿 酸，且几乎没有毒副作用；在治疗肿瘤裂解综合征时，尿酸氧化酶比别嚷岭醇更安全有效； 用于治疗痛风，能快速分解关节处沉积的尿酸从而消除引发的炎症和皮肤损伤。
[0004] 尿酸氧化酶是一种新型的降尿酸药物，它W促进尿酸分解为药物特征。其中一种 重组黄曲霉尿酸氧化酶（商品名：拉布立酶）被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综 合征。但是尿酸氧化酶又是一种外源蛋白，直接或重复使用易引发抗体降低疗效，而且易 过敏，需静脉注射，仅适于短期使用W降低尿酸（如使用拉布立酶治疗时间不能超过一个 月）。所W对于长期治疗，显然需要长效且无免疫原性的尿酸氧化酶制剂，聚乙二醇化重组 尿酸氧化酶能够解决应用天然酶时遇到的运些问题。 阳〇化]本发明申请人制备的聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶是从产航假丝 酵母中提取基因组DNA，通过PCR扩增，设计特定的引物，从产航假丝酵母基因组中分离尿 酸氧化酶基因，并将其插入到大肠杆菌表达质粒中，得到重组产航假丝酵母尿酸氧化酶转 化子，再将重组产航假丝酵母尿酸氧化酶转化子转化入大肠杆菌中，得到可高效表达尿酸 氧化酶的大肠杆菌工程菌株。再经过发酵培养，收获表达重组重组产航假丝酵母尿酸氧化 酶的菌体，在经过菌体裂解、柱层析纯化得到纯化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶（详见 发明专利化02819387. 3)。纯化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶经特定的聚乙二醇修饰，修 饰后经超滤或柱层析方法进一步纯化，得到聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶。
[0006] 众所周知早期的对尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰会引起尿酸氧化酶蛋白特异性活 性的大大降低，仅能保持修饰前蛋白的30 % -50%的活力。本发明选用的PEG连接基团修 饰后不影尿酸氧化酶特异性的酶活力。
[0007] 根据本发明申请人对聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶的研究发现，将 其制作成水针注射剂，在存放的过程中连接上的PEG会有少量脱落现象，其稳定性会受到 很大影响，因此为延长效期，将其制作成新型的冻干粉针注射剂。
[0008] 聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶由于本身结构的复杂性，其冷冻干燥 的Ξ个阶段（低溫效应、冻结效应和脱水效应）都可能导致活性的下降或丧失。聚乙二醇化 的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶在降溫与复溫的过程中会发生变性。在冻结的过程中，由 于产生大量的冰水界面，聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶会吸附在界面上，从 而破坏天然的權皱结构，导致变性。冻结过程中由于溶液pH的变化导致聚乙二醇化的重组 产航假丝酵母尿酸氧化酶活性的下降，例如使用简单的憐酸盐缓冲液作为冻干缓冲液，在 冷冻过程中，NaH2P〇4的溶解度远远大于化2册〇4,随着化2册〇4的析出，最终导致溶液抑值的 巨大改变。在脱水过程中，由于之前聚乙二醇化重组尿酸氧化酶与水溶液充分的水合作用， 使其表面吸附了一单层水，即水合层，脱水过程将去除一部分结合水，使得富含结合水的聚 乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶暴露在乏水的环境中，致使将质子转化为带电簇 酸基团，破坏其电荷的平衡，电荷密度的降低促进了聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸 氧化酶分子之间的疏水作用，使其发生聚集。并且在完成冷冻干燥后，在储存的过程中，也 会发生聚集、脱酷胺、氧化、水解等作用。因此为使聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧 化酶在冷冻干燥和储存的过程中，活性的损失达到最小，冷冻干燥工艺的开发和制剂配方 的筛选尤为重要。
【发明内容】
[0009] 定义：PEG,聚乙二醇；SS，班巧酷亚胺基班巧酸醋；SCM，班巧酷亚胺基簇甲基醋。
[0010] "聚乙二醇"或叩EG"指环氧乙烧缩聚物和水的混合物，可W是直链或带有支链。 由通式!K〇CH2CH2)n〇H表示，其中η至少为4,"聚乙二醇"或"PEG"与数字后缀结合表示其 大约的重均分子量。例如阳G-5K指总重均分子量为5000的聚乙二醇。
[0011] 通常修饰用的聚乙二醇的两个醇径基的一端用甲氧基封闭，另一端结合上连接基 团。例如一端甲氧基封闭，另一端连接基团为班巧酷亚胺基班巧酸醋的聚乙二醇，缩写为 mSS-PEG。化学结构式如下：
[0012]
[0013] 本发明的目的是提供一种能保持尿酸氧化酶活性并降低其免疫原性的聚乙二醇 修饰方法，w及一种储存稳定并能在短时间内重溶并且复性的聚乙二醇化的尿酸氧化酶冻 干注射剂及其冷冻干燥工艺。所述冻干注射剂用于治疗由人体内血尿酸升高而引起的各种 疾病。
[0014] 由于产航假丝酵母尿酸氧化酶的结构与其他蛋白相比非常特殊，其由同源四聚体 组成，四聚体间W作用力轻微的氨键和疏水键做为主要结构作用力，因此四聚体在稍剧烈 的条件下就解聚成单体，同时尿酸氧化酶必须在完整的四聚体结构下才拥有活性，在单体 的条件下活性完全丧失，而在八聚体及多聚体条件下免疫原性会增强，由于尿酸氧化酶蛋 白本身稳定性较差，纯化的尿酸氧化酶蛋白非常容易进一步聚合成多聚体，使得尿酸氧化 酶蛋白本身的成药性差。而聚乙二醇修饰后的尿酸氧化酶稳定性明显提高，因此对尿酸氧 化酶进行聚乙二醇修饰即可保持其酶的活性，还能降低其免疫原性，大大增加了其成药性。 聚乙二醇修饰反应的评价指标主要为尿酸氧化酶蛋白的活性的保持及免疫原性的降低。用 于修饰反应的聚乙二醇的分子量可选5K-40K，其中最优选为20K。在本发明的一些实施例 中检测不同分子量的聚乙二醇修饰后的产物活性及免疫原性。实验数据显示分子量为20K 的修饰产物在保持酶活力及降低免疫原性两方面均有明显的优势。
[0015] 在冻干制剂配方和冻干工艺研究中，保持酶的活性是重要的评价指标，同时关注 冻干后样品的外观，水分残留和复溶情况。因此冻干制剂的配方非常复杂，即如下：
[0016] (1)0. 5~15mg/ml聚乙二醇化的重组产航假丝酵母尿酸氧化酶（W下简称聚乙二 醇化重组尿酸氧化酶）；
[0017] 似50~200mM注射用缓冲液，pH值范围5. 5~8. 0 ; 阳〇1引 （3)0. 5~3% (体积/体积百分比）填充剂。
[0019] 本发明所述冻干注射剂为多位点聚乙二醇修饰，修饰后的尿酸氧化酶蛋白粘度明 显增加，因此聚乙二