一种阿霉素共载药系统、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗癌药物领域，更具体地，涉及一种阿霉素共载药系统、其制备方法及 应用。
【背景技术】
[0002] 阿霉素（doxorubicin)又称多柔比星，属于高效的广谱抗癌药物。阿霉素单独或 与其他抗肿瘤药物联合用药，均被认为是治疗实体肿瘤的一种强有力的化疗药物。但是阿 霉素对必脏、肾脏及神经等正常组织细胞有较严重的毒副作用。同时，能到达病灶部位发挥 抗肿瘤的比例很低，W及容易产生耐药性送些缺陷使其临床应用受到限制。为解决W上难 题，国内外专家对各种药物载体进行深入的研究，W实现阿霉素的祀向给药，从而提高阿霉 素在肿瘤部位的分布，从而提高疗效，并降低其毒副作用。临床前药理实验W及临床研究均 已证明，用脂质体载运的阿霉素抗肿瘤作用类似于游离的阿霉素制剂，但毒性显著降低。杨 秀岭等报道了脂质体包封阿霉素后可增加阿霉素的祀向性，降低了阿霉素对必脏、骨髓的 毒性。
[0003]然而，由于脂质体的选择性不高，现有的脂质体阿霉素给药系统，仍存在毒性较 强，W及疗效欠佳的问题。现有的脂质体载药系统当采用阳离子脂质体时，组织摄取提高， 但毒性也随着增加；当采用中性脂质体时，毒性下降，但递送效率也降低。同时肿瘤细胞对 阿霉素脂质体，仍然容易产生耐药性，导致癌症复发时，疗效不理想，预后不佳的问题。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的W上缺陷或改进需求，本发明提供了一种阿霉素共载药系统、其 制备方法及应用，其目的在于通过表面具有祀向配体和小干扰RNA的阿霉素脂质体提高阿 霉素载药系统的祀向性，增强抗癌活性，降低耐药性，由此解决现有的阿霉素脂质体选择性 不高，毒性相对较强，容易产生耐药性的技术问题。
[0005] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种阿霉素共载药系统，包括 阿霉素活性成分和祀向载体；所述祀向载体其表面共价结合有祀向配体，并运载有小干扰 RNA，用于抑制癌基因表达；所述阿霉素活性成分占所述共载药系统质量百分比在4%至 8%之间；所述祀向配体占所述共载药系统质量百分比在1%至10%之间；所述小干扰占所 述共载药系统质量百分比在0. 5%至2%之间。
[000引优选地，所述阿霉素共载药系统，其祀向配体为叶酸聚己二醇胆固醇。
[0007] 优选地，所述阿霉素共载药系统，其小干扰RNA的祀标基因为癌症发生的驱动基 因Bmil。
[000引优选地，所述阿霉素共载药系统，其小干扰RNA的序列为：
[0009]正义链：5, -CCAGACCACUACUGAAUAUAA-3,；
[0010] 反义链：5 ' -UUAUAUUCAGUAGUGGUCUGGUU-3 '。
[0011] 优选地，所述阿霉素共载药系统，其祀向载体为脂质体。
[0012] 按照本发明的另一方面，提供了一种阿霉素载药系统的制备方法，包括W下步 骤：
[0013] (1)制备叶酸配体的祀向偶联物；将祀向配体与聚己二醇二胺共价连接得到的革己 向配体叶酸-聚己二醇二胺，与胆固醇-对甲苯礙酸醋、Η己胺均匀分散于有机溶剂中得到 溶液Α，使得每毫升溶液A中含有叶酸-聚己二醇二胺在15μmol至20μmol之间，含胆固 醇在20μmol至25μmol之间，Η己胺在35μmol至45μmol之间；将溶液A蒸干溶剂后 得到油状物B，将油状物B加入40mM至60mM的碳酸钢溶液，每毫升碳酸钢溶液对应油状物 B15mg至60mg，混合后离必取上清液C，将上清液C透析并冷冻干燥后得到所述祀向偶联物， 即叶酸聚己二醇胆固醇；
[0014] 似制备阿霉素共载药系统前体；按照配方比例，将步骤（1)中获得的配体的祀向 偶联物与磯脂在有机溶剂中混合，将溶剂蒸干后得到油状物D;向油状物D中加入200mM至 300mM的硫酸倭溶液，每毫升硫酸氨溶液对应油状物D40mg至50mg;水化15分钟至60分 钟后再依次通过聚碳酸醋膜和葡聚糖凝胶柱，得到空白祀向脂质体，将阿霉素盐酸水溶液 加入到空白祀向脂质体中，使得空白祀向脂质体和阿霉素的质量比例在97:3只92:8之间， 进行包封，制得阿霉素共载药系统前体；
[0015] (3)制备阿霉素共载药系统；合成小干扰RNA分子并溶解制成小干扰RNA溶液，与 步骤（2)中获得的阿霉素共载药系统前体均匀混合，使得小干扰RNA分子与共载药系统结 合的质量比例在1:100至1:400之间，静置反应0. 5小时至4小时，即制得所述阿霉素共载 药系统。
[0016] 按照本发明的另一方面，提供了所述阿霉素共载药系统应用于祀向抗癌药物的制 备。
[0017] 优选地，所述阿霉素共载药系统应用于祀向抗癌药物的制备，所述祀向抗癌药物 为祀向抗实体瘤药物。
[0018] 总体而言，通过本发明所构思的W上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有 益效果：
[001引 （1)本发明提供的阿霉素共载药系统，通过共载药化疗药物和siRNA，即能够快速 起效，也能够通过siRNA的特异性增强治疗的针对性，同时，siRNA治疗可W增加肿瘤细胞 对化疗药物的敏感性，从而实现协同作用，增强药效，降低耐药性。
[0020] 似所述载药系统，通过祀向配体实现祀向给药，尤其是叶酸作为祀向配体时，采 用胆固醇来铺定，由于胆固醇和PEG之间通过C-N键连接，增加了配体的稳定性，避免了醜 胺键链接导致的水解问题，在给药量一定的情况下，增强了疗效、降低了毒性。
[0021] (3)本载体系统将带负电荷的siRNA和带正电荷阳离子脂质体结合，从而降低了 阳离子脂质体的正电荷。一方面保留了阳离子脂质体的高摄取特性，另一方面又降低了阳 离子脂质体的高毒性。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明提供的阿霉素共载药系统的结构示意图；
[0023] 图2是叶酸聚己二醇胆固醇合成路径；
[0024] 图3是叶酸-聚己二醇二胺合成路径；
[0025] 图4是胆固醇-对甲苯礙酸醋合成路径；
[0026] 图5是祀向配体叶酸聚己二醇胆固醇的质谱图；
[0027] 图6是本发明提供的阿霉素共载药系统递送阿霉素（DO讶和小干扰RNA(siRNA) 进入邸细胞；
[002引图7是本发明提供的阿霉素共载药系统递送阿霉素（DO讶和小干扰RNA(siRNA)进入化La细胞；
[0029] 图8是本发明提供的阿霉素共载药系统递送小干扰RNA到邸细胞可W抑制目标 基因的表达；
[0030] 图9是本发明提供的阿霉素共载药系统对邸，化LaW及化p3B癌细胞的抑制作 用；
[0031] 图10是本发明提供的阿霉素共载药系统在裸鼠移植瘤模型中治疗肿瘤的效果。
[0032] 在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：
[0033] 化ol-OTs为胆固醇-对甲苯礙酸醋，化ol-siRNA为胆固醇偶联小干扰RNA，D0X-L 为阿霉素脂质体，DCC为N，Ν'-二环己基碳二亚胺，DMS0为二甲亚讽，DS阳为二硬脂醜磯脂 醜己醇胺，D0TAP;1，2-二油醜基居丙基-3-Ν，Ν，Ν-Η甲倭氯，FA为叶酸，FA-PEG-bis-amine 为叶酸聚己二醇二胺，FA-PEG-化〇1为叶酸聚己二醇胆固醇，FA-DOX-L为叶酸祀向阿霉素 共载药系统前体，FA-DOX/siRNA-L为叶酸祀向阿霉素共载药系统，N服为N-居基玻巧醜亚 胺，PEG为聚己二醇。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可W相互组合。
[0035] 本发明提供的阿霉素共载药系统，如图1所示，包括阿霉素活性成分和祀向载体； 所述祀向载体其表面共价结合有祀向配体，并运载有小干扰RNA，用于抑制癌基因表达；所 述阿霉素活性成分占所述共载药系统质量百分比在4%至8%之间；所述祀向配体占所述 共载药系统质量百分比在1%至10%之间；所述小干扰RNA占所述共载药系统质量百分比 在0. 5%至2%之间。
[0036] 所述祀向配体优选为叶酸聚己二醇胆固醇配体。
[0037] 所述小干扰RNA的祀标基因为癌症发生的驱动基因，优选Bmil基因，其序列为：
[0038]正义链：5, -CCAGACCACUACUGAAUAUAA-3,；
[003引 反义链：5 ' -UUAUAUUCAGUAGUGGUCUGGUU-3 '。
[0040] 干扰癌症发生的驱动基因的表达，能发挥有效的抗癌活性。Bmil基因为常见的癌 症发生的驱动基因，因此干扰其表达的siRNA，可应用于本发明提供的阿霉素共载药系统。
[0041] 所述祀向载体优选为脂质体。
[0042] 实验证实，所述阿霉素共载药系统的粒径在120-160nm之间，zeta电位在 17. 6-45. 6之间时，在体外，肿瘤细胞对共载药系统递送的BmilsiRNA摄取良好，在mRNA 水平W及蛋白水平抑制B