用纳米线的分子递送的利记博彩app
【专利说明】用纳米线的分子递送
[0001]【相关申请】
[0002]本申请是申请号为201180051218.4的专利申请的分案申请。
[0003]本申请要求2010年9月29日提交的美国临时申请61/387，604和2011年3月14日提交的美国临时申请61/452，283的优先权。这些现有申请通过引用以其整体并入本文。
[0004]【联邦资助的研究声明】
[0005]本发明在国家健康学会合同号1DP10D003893-01资助下政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。
【【背景技术】】
[0006]外源遗传物质递送进细胞可以病毒(例如，使用腺伴随或慢病毒载体)方式，化学(例如，使用磷酸钙，脂质体或聚阳离子)方式，机械(例如，微注射)方式，及或物理学(例如，电穿孔)方式达到。
[0007]在这些输送递送方法中，通过在2个并行电极之间形成的均一的电场中放置细胞来实现AAA电穿孔。当跨膜电势超过阈值水平约0.25?IV时，细胞膜的脂质双层重排列而形成亲水孔隙(一般直径在20?120nm之间)。小于孔径的任何分子，可由电泳或扩散流入细胞。一般而言，为电穿孔溶液中悬浮的细胞，需要延续几ys?ms的约1000V(随细胞尺寸改变)的脉冲。
[0008]虽然此方法对于特定细胞工作有效，小免疫细胞和神经元的电穿孔是欠成功的。当将均一的电场应用于电穿孔用小细胞或神经元时，细胞膜的大级分上的电势在破断电势以上，导致低细胞活力。需要开发用于这些细胞的改善的电穿孔方法。
[0009]【发明概述】
[0010]本发明基于如下预料不到的发现，使用一组导电纳米线共同作为细胞内电极，幅度小于10V的电压波形可有效电穿孔细胞。
[0011]—方面，本发明涉及分子递送装置，其包括(i)基体及(ii)附接于表面的多个纳米线。基体导电，且纳米线用导电层包被。
[0012]上述装置中使用的导电基体可为由具有用导电材料包被的表面的非-导电或半导电材料制造的基体和表面与纳米线通电。或者，其可由导电材料制造。用于基体的材料的例包括半导体(例如，Si和Ge)，化合物半导体(例如，InP和GaA)，金属氧化物(例如，ΖηΟ, ΙΤ0和Ir氧化物)，及金属(例如，Au, Pt, Ag, Ir和Cr)。
[0013]术语“纳米线”(或在本文称为“NW”)指称具有lnm?Ιμπι范围的直径的线，杆或锥的形状的物质。在本文中，锥具有0?90度(例如，0-15度)范围的半角。NW优选沿着与表面基本上垂直方向(即，60-90度)附接于表面。它们可具有20?10，OOOnm (例如，100-5，OOOnm 和 800-1，200nm)的高度，10 ?500nm(例如，50 ?250nm 和 70 ?180nm)的直径，及0.05-10线μ m 2 (例如，0.1-5线μ m 2和0.2-2线μπι 2)的密度。它们可由半导体(例如，Si和Ge)，化合物半导体(例如，GaA和InP)，金属氧化物(例如，ΖηΟ)，金属(例如，Au, Ag, Ir, Pt)，碳，氮化硼，或其组合形成。
[0014]包被在NW和基体的导电层可由金属(例如，Au, Ag, Pt, Pd, Cr, Ni, Ir, Al, ff, Ti和Fe)，金属氧化物(例如，Ir氧化物，ITO和ΖηΟ)，半导体(例如，Si和Ge)，化合物半导体(例如，GaA, GaP, InP, InA, InGaA和GaN)，金属氮化物(例如，TiN, ZrN和TaN)，或其组合形成。
[0015]化合物半导体可由2个或更多元件形成，诸如IV-1V半导体(例如，SiC和SiGe)，II1-V 半导体(例如，AIN, A1P, AlGaA, GaN, GaA, InP 和 InGaA)，I1-V 半导体(例如，Zn3Sb2和 Cd3As2)，I1-VI 半导体(例如，CdS, CdSe 和 CdTe)，IV-VI 半导体(例如，SnS 和 PbSnTe)，
1-VI半导体(例如，Cu2S)，1-VII半导体(例如，CuCl)，及氧化物半导体(例如，Sn02, CuO和Cu20)。除非另外陈述，用于本发明的电装置的半导体包括其固有形式(即，纯形式)及掺杂的形式(即，含有一种或更多掺杂物)。术语“组合”指称2种或更多组分的混合物，合金，或适合的反应产物。例如，“硅和金属的组合”可为硅和金属的混合物或金属硅化物。
[0016]在另一方面，本发明涉及将外源分子递送进细胞的方法。方法包括提供(i)具有表面的基体和多个附接于表面的NW，基体和各NW导电；(ii)使NW与细胞接触以使NW穿透进细胞；及(iii)在浴溶液中基体和电极之间施加电流或电压波形。结果，分子通过细胞膜中瞬时形成的孔隙进入细胞。导电NW可⑴由具有用导电材料包被的表面的非-导电或半导电材料制造和NW附接的表面与基体表面通电；或⑵由导电材料制造。
[0017]此方法中使用的装置与上述的相同，除了在此方法中使用的NW可用导电层包被或不包被之外。
[0018]待递送的分子可为核酸(例如，DNA和RNA包括siRNA和微RNA)，蛋白，多糖，或小分子。术语“小分子”指称具有lOOODa以下的分子量的任何分子，包括各种药物分子，焚光染料，寡糖，寡核苷酸和肽。
[0019]细胞可为原核生物细胞(例如，大肠埃希氏菌(E.coli))或真核生物细胞(例如，酵母细胞和人细胞)。人细胞可为原代细胞，转化的细胞(例如，HEK细胞)，或癌细胞(例如，HeLa细胞)。原代细胞可为卵母细胞，神经元，成神经细胞，β细胞，肌细胞，成骨细胞，成纤维细胞，角质形成细胞，单核细胞，免疫细胞，或干细胞。免疫细胞可为巨噬细胞，自然杀伤细胞，Τ细胞，及Β细胞，及树突细胞。干细胞可为胚胎干细胞或成年干细胞(例如，造血干细胞和间叶干细胞)。优选地，各生物学细胞由2种或更多NW穿透。
[0020]电信号可为电流或电压信号。电压波形幅度是0.1?10V(例如，3?7V和4?6V)。术语“波形”是作为时间的函数的电压(或电流)幅度的标绘图。这是矩形，三角形，锯齿或窦状形状的脉冲的一般术语。
[0021]本发明的再一方面涉及将外源分子递送进细胞的方法。方法包括(i)提供具有表面的基体，其用绝缘的层，及多个导电纳米线包被，具有第1端和第2端的各导电纳米线除了第1和第2端之外用电绝缘层包被，第1端附接于表面和第2端用导电层包被；(ii)使纳米线与含有分子的浴溶液中浸渍的细胞接触以使一个或更多纳米线穿透进细胞；及(iii)在2个电极之间施加电流或电压波形，一个连接到各纳米线的第1端和其他放进浴溶液。结果，分子通过细胞膜上瞬时形成的孔隙进入细胞。
[0022]此方法中使用的基体可由半导体(例如，Si)，化合物半导体(例如，GaA, InP, GaN和GaP)，或金刚石形成。其用电绝缘的层包被。在此方法中使用的NW与上述那些相同，除了各NW的2端之间的区用电绝缘的层包被之外。此外，各NW可由电压波形个别达至IJ。电绝缘层由下列物质形成:氧化物(例如，氧化硅，矾土和氧化铪)，氮化物(例如，氮化娃)或其组合。或者，电绝缘层由下列物质形成:有机物质，诸如Parylene(例如，Parylene C, N, AF-4，SF, HT, A, AM, VT-4或CF)，聚二甲基硅氧烷，甲基丙烯酸甲酯，光刻胶(例如，SU-8)，及电子光刻胶(例如，聚甲基甲基丙烯酸酯，ZEP-520和氢硅倍半氧烷)。
[0023]细胞可为上述原核生物细胞和真核生物细胞。待递送的分子也可为核酸，蛋白，多糖，或小分子。电信号可为电流或电压信号。电压波形幅度是0.1?10V。
[0024]2种上述基于NW的电穿孔方法的一个优势是达到分子递送需要的低电压波形，SP，在10V幅度下。其是约100倍少于由商业电穿孔系统使用的那些。降低需要的电压不仅使仪表更能承受，其也降低可导致细胞死亡的弯曲的似然性。而且，这些方法可用于通过改变它们的几何(例如，尺寸)或