具有抗糖尿病和其它有用活性的植物提取物的利记博彩app

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【专利说明】具有抗糖尿病和其有用活性的植物提取物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求在2013年3月12日提交的美国申请No. 61/777, 657和在2013年3 月12日提交的美国申请No. 61/777, 927的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明设及含有营养有益或药用活性化合物的植物提取物。运些提取物中的一些 或其中所含纯化的化合物可通过调节膜岛素信号传导用于营养支持、预防、治疗或可能治 愈人类和动物中各种代谢性和其它疾病和病症，包括1型和2型糖尿病。此调节效应可包 括调控体内细胞和组织中膜岛素受体（1时、膜岛素样生长因子（IG巧受体和/或膜岛素受 体底物（IR巧蛋白的水平和/或活性。主要重点是针对IRS蛋白。IRS蛋白家族中的两个 成员，IRS1和IRS2,是膜岛素生长因子信号传导通路或膜岛素样生长因子信号传导通路中 的部分，但也通过其它生长因子和细胞因子介导信号，包括IFN-丫、比-2、比-4、比-7、比-9、 比-13或IL-15、生长激素、催乳素或瘦素。IRS1或IRS2功能活性也整合从促炎性细胞因子 所发出的信号，促炎性细胞因子包括TNF-a、比-6、IL-ie及相关因子。通常，促炎性细胞 因子抑制IRS1/IRS2信号传导，其促成膜岛素抗性综合症。
[0004]发明背景
[0005] 糖尿病是一种已知超过2000年的复杂的，且可威胁生命的疾病。它发生在各种哺 乳动物中，如猴子、犬、大鼠、小鼠和人。Banting和Best在1921年发现和提纯膜岛素及后 来膜岛素对人的治疗用途在医学科学中是里程碑进步，且提供对糖尿病局部治疗，其今天 仍在广泛使用。一般情况下，膜岛素水平基于每时每刻由机体调节来维持血糖水平在狭窄 的生理范围之内。然而，在糖尿病患者中，周期性膜岛素注射只能接近正常状态，由于在许 多情况下，在如肝脏、肌肉和脂肪的器官和组织中对膜岛素的细胞应答也降低。因此，由于 W下将详细讨论的运些和其它原因，在治疗的糖尿病患者的一生中，威胁生命的并发症仍 然出现，特别是2型（成年发病型）糖尿病的情况。（1)
[0006] 糖尿病是由各种原因引起的，包括自身免疫介导的β-细胞破坏（1型糖尿病）； 0-细胞膜岛素分泌能力不足W补偿外周膜岛素抗性（2型糖尿病）；W及葡萄糖传感或膜 岛素分泌受损（青年成熟期发病型糖尿病；M0DY) (1)。1型糖尿病在遗传上是复杂的，且通 过循环针对多种膜岛抗原的自身抗体所引起。膜岛素被认为是1型糖尿病的发病机理中主 要自身抗原中的一种，但其它抗原值得关注（2)。由于当1型糖尿病进展时，新的β-细胞 形成缓慢发生，所W可能需要在减弱自身免疫应答时通过加速β-细胞再生的速率来治疗 该疾病（3)。
[0007]2型糖尿病是糖尿病最常见的形式。虽然它通常出现在中年，但在发达国家中 2型糖尿病在儿童和青少年中变得越来越常见。生理应激-对创伤、炎症或过量营养物 的应答-通过在各种组织中激活损伤对膜岛素的受体后应答的通路来促进2型糖尿病 (1)。遗传变异也改变对促进2型糖尿病的环境和营养因素的应答。在少量信息情况中， 膜岛素受体或ΑΚΤ2中突变解释严重形式的膜岛素抗性（4)。然而，2型糖尿病的常见形 式与对膜岛素作用有适度效应的多基因变体相关-包括过氧化物酶体增生物激活受体 丫（PPARG)、过氧化物酶体增生物激活受体丫共激活物Ια(PPARGC1A)、向内整流K+-通道 Kir6. 2〇(CNJll)、巧蛋白酶-IO(CAPNIO)、转录因子7-样2灯CF化2)、脂联素（ADIPOQ)、脂联 素受体2 (ADIP0R2)、肝细胞核因子4α(HNF4A)、解偶联蛋白-2扣CP2)、固醇调节元件结合 转录因子USREBF1)或高血浆浓度白细胞介素-6巧）。虽然每个基因的效应小，但运些发现 为2型糖尿病的发病机理提供重要线索。
[000引不论潜在的病因，由慢性高血糖症及补偿性高膜岛素血症加剧的膜岛素信号传导 失调促进一组急性和慢性后遗症化）。未治疗的糖尿病进展为酬酸中毒（在1型糖尿病中 最为常见）或高血糖渗透性应激（在2型糖尿病中最为常见），运是导致发病率和死亡率的 直接原因。从长期来看，糖尿病与许多威胁生命的慢性并发症相关。由于糖尿病患者中出 现的脑血管疾病明显增加，所W脑中风发病率比非糖尿病人群高Ξ倍。同样地，由于高血糖 症与其它屯、血管危险因子的协同效应，在糖尿病患者中屯、血管疾病如外周血管疾病、充血 性屯、脏衰竭、冠状动脉疾病和屯、肌梗死一致增加。而且，屯、血管功能减弱与全身氧化应激的 联合效应造成对视网膜毛细血管内皮细胞损伤（导致失明）、对肾小球系膜细胞损伤从而 引起肾衰竭W及对周围神经损伤造成神经病变从而引起四肢疼痛和麻木（7)。
[0009] 糖尿病也与中枢神经系统的年龄相关性变性相关。超过85-90岁的人显示出膜岛 素抗性比预期弱-且令人惊讶的是，百岁老人对膜岛素敏感（8)。可促进外周膜岛素敏感 性、且减少维持正常的葡萄糖稳态所需的循环膜岛素浓度的化合物提供对葡萄糖不耐受及 其进展为威胁生命的糖尿病的理想疗法。
[0010] 膜岛素、膜岛素样生长因子和受体
[0011] 哺乳动物产生Ξ种膜岛素样肤-膜岛素、膜岛素样生长因子-l(IGF-l)和膜岛素 样生长因子-2QGF-2)-其可激活由膜岛素受体（IR)基因和膜岛素样生长因子-1受体 "GF1巧基因所编码的五种同源性膜岛素样受体酪氨酸激酶（图lA/巧。膜腺β-细胞应 答循环葡萄糖浓度产生膜岛素，然而内分泌IGF-1很大程度上分泌自通过营养物和生长激 素刺激的肝细胞；IGF-1和IGF-2也在许多组织和细胞局部产生，包括中枢神经系统巧）。 IGF1可与膜岛素协同作用来调节营养物稳态、膜岛素敏感性和膜腺β-细胞功能巧）。膜 岛素受体基因和IGF受体基因编码形成共价连接二聚体的同源前体，该二聚体可通过蛋白 水解裂解W生成具有两个细胞外α-亚基和两个跨膜β-亚基的四聚体。细胞外α-亚 基创建配体结合结构域，其可调节位于跨膜β-亚基的细胞内部分上的酪氨酸激酶的活性 (10)。
[0012] 高亲和力配体结合诱导β-亚基的催化结构域内的结构转变，运促进激酶调节环 (IRa)-Tyrll58、Tyrll62和Tyrll63中Ξ个酪氨酸残基的憐酸化（11)。自憐酸化从其抑 制位置释放调节环，运打开催化位点W使其它蛋白憐酸化（12)。憐酸化的调节环还可与调 控激酶活性的其它信号传导蛋白相互作用，包括GrblO、Grbl4、AI^和甜2B(13)。位于激酶 结构域W外，且邻近质膜的N阳Y-基序内的第四个酪氨酸残基（I化中的Tyr960 ;IRa中的 Tyr972 ;IGF1R中的Tyr950)也可被憐酸化，运募集膜岛素受体底物（IRS-蛋白）W通过激 活的受体激酶进行酪氨酸憐酸化（14)。
[0013] 膜岛素受体底物
[0014] 基于细胞和基于小鼠的实验显示，通过IRS1、IRS2或其同系物或其它支架蛋白包 括甜C、CBLAI^和甜28、6481、6482、000(1和000(2的酪氨酸憐酸化来产生或调控大多数 即便不是全部膜岛素信号（15)。虽然运些底物中每一个的作用值得关注，但是转基因小鼠 研究表明很多膜岛素应答-特别是与体细胞生长和营养物稳态相关的那些-通过IRS1或 IRS2来介导（1)。
[0015] 在1985年发现膜岛素受体底物蛋白家族的第一成员，且随后的研究成果掲示存 在相关的IRS家族成员W及IRS蛋白连接的信号传导通路。在发现膜岛素受体（IR)具有 酪氨酸激酶酶活性之后，许多团体研究可能调节受体下游信号传导的膜岛素受体底物。存 在膜岛素受体的实际祀蛋白（随后命名为膜岛素受体底物，或"IRS"蛋白）的第一个证据 来自憐酸化酪氨酸抗体免疫沉淀物的使用，令人惊讶的是，其在膜岛素刺激的肝癌细胞中 掲示185-kDa的憐蛋白（ppl85)(16)。PP185的纯化和分子克隆掲示第一信号传导支架之 一W及第一膜岛素受体底物蛋白（IRS1) (17,18)。IRS1被确定为具有生物学上的重要性， 因为它在膜岛素刺激后立即憐酸化，且不能使IRS1憐酸化的催化活性的膜岛素受体突变 体没有生物学活性。
[0016]多次实验表明可能存在其它相关蛋白，其可导致膜岛素受体底物2QRS2)的纯化 和克隆，IRS2是IRS家族的第二成员（19, 20)。
[0017] 转基因小鼠的实验掲示IRS1和IRS2参与促进体细胞生长和营养物稳态。在无 IRS1的情况下，从出生到2岁死亡，小鼠比正常情况下小50%。无IRS1的小鼠具有更少的 体脂且是葡萄糖不耐受的。在小鼠中，IRS2对于外周膜岛素作用是重要的，因为缺少IRS2 的小鼠展示葡萄糖不耐受性和高脂血症。
[001引使用标准基因敲除方法破坏小鼠IRS2基因造成在8-12周龄间患有的糖尿病。随 着年龄增长，膜腺β-细胞从运些小鼠内丢失，且对β-细胞功能是重要的基因在缺乏IRS2 的小鼠内失调。
[0019]IRS蛋白是衔接分子，其将膜岛素样受体连接至常见下游信号传导级联（图1Α/ Β)。在晒齿类动物中已经鉴定四种IRS-蛋白基因，但运些基因中只有3种基因（IRS1、IRS2 和IRS4)在人中表达。IRS1和IRS2在哺乳动物组织中广泛表达，而IRS4很大程度上限制 到下丘脑，且在其它少数组织中低水平表达。运些蛋白的每一个是通过Ν肥端普列克底物 蛋白（pleckstrin)同源性（ΡΗ)结构域祀向于激活的膜岛素样受体。ΡΤΒ结构域特异性结 合于激活的受体激酶中憐酸化的N阳Y-基序（1)。PH结构域也促进IRS蛋白和IR之间的 相互作用，但该机制知之甚少。IRS-蛋白中的PH结构域充当特定作用，由于其可在IRS-蛋 白之间互换，而无明显生物活性损失，但异源PH结构域取代正常PH结构域时，其抑制IRS1 功能（21)。除了PH和PTB结构域外，IRS2也利用另一个机制与激活的膜岛素受体相互作 用倘）。
[0020] IRS-P13K-AKT级联
[0021] 研究的最好的膜岛素样信号传导级联之一设及通过憐脂酷肌醇3-激酶（PI3-激 酶）产生PI-3,4,5-P3。1型PI3-激酶是由含有2个src-同源性-2(S肥）结构域的调节亚 基和催化亚基构成，该催化亚基由调节亚基所抑制，直到调节亚基的甜2结构域被IRS-蛋 白中憐酸化的酪氨酸残基所占据（23)。PI-3,4,5-P3将丝氨酸/苏氨酸-激酶PDK1和 AKT(又称为P邸）募集到质膜，其中AKT由PDK-1介导的憐酸化所激活（图1A/B)。AKT使 很多蛋白憐酸化，此类蛋白在细胞存活、生长、增殖、血管生成、代谢和迁移中充当核屯、作用 (24)。多个真性AKT底物的憐酸化与膜岛素样信号传导特别相关：GSK3a/e(阻断糖原合 酶的抑制）、AS160 (促进GLUT4易位）、BAD·BCL2杂二聚体（抑制细胞调亡）、FOXO转录 因子（调苄基因表达）、P21CIP1和P27KIP1 (阻断细胞周期抑制）、eNOS(刺激NO合成和 血管舒张）W及PDE3b(水解cAMP)(图1A/B)。AKT还使马铃馨球蛋白（TSC2)憐酸化，运 抑制其GAP对小G-蛋白RH邸的活性，小G-蛋白RH邸促进激活mTOR的RH邸'GTP复合物 的聚积（24):该通路提供细胞生长所需的膜岛素信号传导和蛋白合成之间的直接联系（图 1A/B)。
[0022] 通过大量的基于细胞的实验和基于小鼠的实验验证IRS-蛋白在PI3K-AKT信号 传导级联中的作用。虽然IRS1最初从大鼠肝细胞中纯化和克隆，但IRS1和IRS2在体内肝 细胞的膜岛素信号传导中的主要作用只是在最近才得到证实（25)。最简单的实验采用将膜 岛素腹腔内注射入普通小鼠或缺乏肝IRS1和IRS2的小鼠。在普通小鼠中，膜岛素迅速刺 激Akt憐酸化，及其下游底物化xol和Gsk3α/β的憐酸化。必须删除IRS1和IRS2两者， W使膜岛素受体从ΡΙ3Κ-ΑΚΤ级联解禪合（25)。运些结果确认肝膜岛素信号传导对IRS1 或IRS2共同但又绝对的要求。
[002引 IRS2的转录调节
[0024] 调节IRS-蛋白信号传导是协调各种组织中膜岛素应答的强度和持续时间的重要 方式，但是运些机制失败可引起膜岛素抗性。IRS1基因的转录通常是稳定的。相比之下，IRS2的产生由多种营养物敏感性转录因子调节，包括cAMP应答元件结合蛋白（CREB)及 其结合配偶体CRTC2、叉头框01 (F0X01)、转录因子E3 (TFE3)W及固醇调节元件结合/因 子-lc(SREBF-lc) (26,27)。有趣的是，CREB/CRTC2转录复合物-其结合cAMP应答元件 (CRE)-对β-细胞和肝脏中的IRS2表达具有相反效应。餐后，从葡萄糖氧化产生ATP使 0 -细胞去极化，运可促进化化流入和cAMP产生，运具有很多重要效应，包括激活CREB/ CRTC2(26)。因此，葡萄糖与β-细胞内IRS2表达直接禪合，运刺激β-细胞生长和代偿性 膜岛素分泌。相比之下，CREB/CRTC2促进空腹肝脏内IRS2表达，运可通过增强基础膜岛素 应答来抑制糖异生作用。
[002引除了cAMP应答元件，IRS2基因的启动子区包括结合F0X0家族成员的元件、结合T阳3的E-框W及由SREBF-lc识别的固醇应答元件（SR巧（27)。F0X01将PI3K-AKT级联与 细胞生长、存活和代谢中重要基因的表达联系起来。在肝脏，IRS1和IRS2促进F0X01的憐 酸化、核输出和降解，运减少IRS2表达。此外，在营养过剩和慢性膜岛素刺激期间SREBF-lc 浓度增加，运抑制F0X01-介导的IRS2表达（28)。运种互相调节的不平衡似乎促成导致代 谢综合症和糖尿病发展的过度营养的病理生理效应。因此，预期促进IRS2信号传导的化合 物对肝脏膜岛素作用具有强大的规范效应，特别是在营养过剩期间。
[0026] 膜岛素抗性与IRS蛋白信号传导失调。
[0027] 膜岛素抗性是常见病理状态，其与许多健康病症-肥胖、高血压、慢性感染、女性 生殖失调W及肾脏疾病和屯、血管疾病相关（1)。在过去15年中，基于小鼠的实验已经掲示 介导膜岛素信号、调控膜岛素信号或对膜岛素信号应答的基因中的突变如何促成膜岛素抗 性和糖尿病。然而遗传突变是终生膜岛素抗性的明显来源，它们通常与罕见代谢病症有关。 环境、生理和免疫应激通过复杂遗传背景协调的异源信号传导级联引起膜岛素抗性（1)。
[0028] 肥胖本质上与外周膜岛素抗性相关。最近研究掲示从脂肪组织分泌的多种可抑制 膜岛素信号传导的因子-FFA、肿瘤坏死因子-α(TNFa)和抵抗素；或促进膜岛素信号传导 的因子-30kDa的脂肪细胞补体-相关蛋白（脂联素）和瘦素。运些因子中的每一种均对 基因表达模式具有特定效应，该基因表达模式可改变细胞对膜岛素的应答。然而，运些因子 对IRS-蛋白的表达或功能的效应能促成膜岛素抗性的机制（29)。在急性外伤或慢性代谢 或炎性应激期间所激活的信号传导级联通过各种机制使IRS-蛋白失调，包括憐酸酶介导 的去憐酸化、蛋白酶体介导的降解和丝氨酸/苏氨酸憐酸化。IRS-蛋白功能失调也提供似 合理的框架来理解当外周膜岛素抗性出现时的代偿性β-细胞功能丢失（30)。
[0029]TNFa实验掲示将炎性细胞因子和膜岛素抗性联系起来的首要机制之一（31)。 TNFα激活N肥-端JUN激酶（JNK)，其使丝氨酸残基上的IRS1憐酸化，该丝氨酸残基抑制 在对膜岛素应答时ΡΙ3-激酶/Akt通路的激活。JNK-介导的IRS1的憐酸化也可能介导细 胞应激效应，包括内质网应激。膜岛素本身通过激活PI3-激酶来促进IRS1的丝氨酸憐酸 化，掲示可能由许多激酶-AKT、PKCC、ΙΚΚβ、JNK、mT0R和S6K1介导的反馈调节（29)。
[0030] 在膜腺β-细胞和膜岛素抗性中IRS2信号传导的核屯、作用。
[0031] 缺乏Irsl或Irs2基因的小鼠是膜岛素抗性的，具有受损的外周葡萄糖利用。两 种类型的敲除小鼠均展示代谢失调，但只有Irs2-/-小鼠在8-12周龄因膜腺β-细胞近乎 完全丧失而患糖尿病（32)。该结果将通过IRS2的膜岛素样信号传导级联定位在β-细胞 功能的中屯、。
[0032] 许多因子是适当β-细胞功能所需要的，包括同源域转录因子Pdxl。Pdxl调节 0-细胞生长和功能所需的下游基因，且PDX1突变引起人常染色体形式的早发性糖尿病 (M0DY)。在Irs2-/-膜岛中Pdxl降低且Pdxl单倍剂量不足进一步减少缺乏Irs2的β细 胞的功能。葡萄糖和膜高血糖素样肤-1对β-细胞生长具有强的效应，运取决于Irs2信 号传导级联（图1B)。在β-细胞中，Irs2是由cAMP和化化激动剂-包括葡萄糖和膜高 血糖素样肤-1 (GLP1)上调-运可激活cAMP应答元件结合蛋白（CREB)和CR邸调节的转录 共激活剂2 (CRTC22) (34)。虽然许多cAMP介导的途径对抗膜岛素作用，但是葡萄糖和GLP1 对IRS2的上调掲示运些重要信号的非预期交叉（图1B)。因此，每日消耗高热量食物造成 的高血糖症促进β-细胞生长，至少部分通过增加IRS2表达（34)。运些结果表明膜岛素样 信号传导级联的Irs2-分支是β-细胞可塑性和功能的"普通守口人（gatekeeper)"。因 此促进IRS2信号传导的化合物可对β细胞生长、存活和功能具有有益效应。
[0033] 外周膜岛素抗性促成2型糖尿病，但β-细胞衰竭是所有类型糖尿病的重要特征。 0 -细胞频繁地无法补偿膜岛素抗性，至少部分因为在目标组织中介导膜岛素信号传导的 膜岛素和IGF信号传导级联的IRS2-分支对于β-细胞生长、功能和存活也是至关重要的 (32)。
[0034] 因为膜岛素抗性是代谢失调和糖尿病的病因，所W了解膜岛素抗性的分子基础是 重要目标。遗传突变是终生膜岛素抗性的明显来源，但它们与罕见代谢病症相关，且因此在 一般人群中难W识别。炎症与膜岛素抗性相关，且提供框架来了解饮食、急性或慢性应激和 肥胖如何可能引起膜岛素抗性。
[0035] 泛素介导的IRS-蛋白降解也促进膜岛素抗性（图1Α/Β)。从白细胞和脂肪细胞分 泌的IL6增加S0CS1和S0CS3的表达，其因阻碍细胞因子信号传导的能力而熟知。S0CS1和 S0CS3的另一个功能是将基于延伸因子BC的泛素连接酶募集到IRS-蛋白复合物来介导泛 素化。因此，泛素介导的IRS-蛋白的降解可能是细胞因子诱导的膜岛素抗性的一般机制， 该膜岛素抗性可促成糖尿病或β-细胞衰竭（35)。
[0036] 蛋白质或脂质憐酸酶（包括ΡΤΡ1Β、