靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系和用于使用该基因递送体系来 治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗体系。更具体地，本发明涉及包括靶向脂肪细胞 的序列（ATS)和九聚精氨酸（R9)肽的非病毒基因递送体系，其中基因递送体系直接靶向已 分化的肥胖（成熟）脂肪细胞。
【背景技术】
[0002] 已经开发了各种基因治疗方法作为传统蛋白质治疗方法的替代。然而，在基因治 疗中仍存在重要挑战。基因治疗的主要挑战之一是在最小细胞毒性下实现基因穿过质膜 (在动物细胞中）和核膜的有效注入。
[0003] 在广义上，基因治疗体系可以被分成病毒载体介导的体系和非病毒载体介导的体 系。病毒载体是使用逆转录酶病毒或腺病毒构建的，并具有高转染到细胞中的效率的优势。 然而，病毒载体具有与体内免疫原性相关的问题并且遭受与基因重组相关的固有问题。在 克服这种病毒载体的稳定性问题的尝试中，已经开发多种等效异位基因递送体系作为传统 基于病毒载体的基因递送策略的替代方案。为了有效的基因递送，等效异位载体需要克服 细胞内的转运障碍，如内体逃逸和核定位。
[0004] 另一方面，在低pH下在内体膜中从基于合成肽的基因递送体系发生基因泄漏，这 导致DNA缩合和快速的内体逃逸。因此，基于合成肽的基因递送体系的使用可以克服等效 异位基因递送体系遇到的问题。因此，已经开发多种合成肽以在数种细胞系中促进体外基 因递送。然而，这些合成肽在体内应用中也遭受毒性和血清不稳定性的问题。
[0005] 如上所述，病毒载体具有免疫应答、自我复制和体内稳定性的问题，而普通等效异 位载体具有以下问题：高细胞毒性和生物毒性以及由于其差的生物相容性引起的低核酸递 送效率。
[0006] 关于这点，正在进行关于使用短阳离子肽的载体的研究。即使在这种情况下，也存 在一些问题，如在细胞外空间不稳定的DNA。载体的其他问题是与DNA的复合物的稳定性差 和基因表达水平低。
[0007] 在这些环境下，存在开发一种特异性针对特定细胞的基因递送载体的需求，所述 基因递送载体具有靶向特定细胞的能力，并有利于DNA到靶向细胞中的注入和DNA从复合 物的释放，实现期望基因的高表达水平。
[0008] 在这一点上，脂肪细胞、特别是成熟的肥胖脂肪细胞是最终分化的细胞并因此很 难转染。在先前的研究中，已经使用电穿孔法来转染脂肪细胞，但是所报道的转染效率仅为 约10%。此外，在体内基因递送体系中，该方法还没有尝试选择性地将基因递送到目标脂肪 组织。
[0009] 因此，本发明人研究了非病毒基因递送体系，结果首次发现以下机制：其中由 特定肽和靶向脂肪细胞的序列（ATS)构成的肽复合物与成熟脂肪细胞中表达的阻抑素 (prohibitin)结合，直接靶向肥胖脂肪细胞，将基因递送到脂肪细胞中，并促进基因的表 达，因此适合于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征。基于该发现完成了本发明。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的问题
[0011] 本发明的一个主要目的是提供一种靶向脂肪细胞的基因递送体系和其中将期望 的基因与基因递送体系结合的复合物。
[0012] 本发明的另一目的是使用基因递送体系来递送用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢 综合征的治疗基因。
[0013] 本发明的又一目的是提供用于预防或治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的药物 组合物。
[0014] 用于解决问题的手段
[0015] 本发明的一个方面提供含有靶向脂肪细胞的序列（ATS)和九聚精氨酸（R9)肽的 靶向脂肪细胞的基因递送体系。
[0016] 靶向脂肪细胞的序列和九聚精氨酸（R9)肽结合至阻抑素，并内化到脂肪细胞中。
[0017] 特别地，九聚精氨酸（R9)肽优选具有CyS-(D-R)9-CyS结构，而靶向脂肪细胞的序 列可以由SEQIDNO: 1中所述的氨基酸序列构成。
[0018] 脂肪细胞优选为已分化的成熟肥胖脂肪细胞，特别是在分化开始后第9至11天的 成熟肥胖脂肪细胞。
[0019] 本发明还提供含有靶向脂肪细胞的序列、九聚精氨酸（R9)肽、和用于治疗肥胖和 肥胖诱导的代谢综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因的复合物。
[0020] 具体地，复合物具有其中用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因如 DNA、siRNA或shRNA与基因递送体系结合的结构。基因递送体系的构成与以上所述的相同。 用于肥胖治疗的治疗基因最优选为iRNA(RNA干扰基因），如siRNA或shRNA。
[0021] 用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的复合物具有200nm或更小 的直径。特别地，纳米尺寸的复合物具有3:1至8:1的电荷比（+/_)。在该范围内，确保高 转染效率。更优选地，复合物具有5:1至8:1的电荷比（+/-)。因为细胞膜带负电荷，所以 当基因递送复合物作为整体带正电荷时获得高的递送效率。带正电荷的复合物可以通过电 荷与电荷的相互作用容易地穿过细胞膜。如果复合物带负电荷，则其不容易地穿过细胞膜。 复合物的电荷的量影响复合物穿过细胞膜的能力。越大量的电荷显示越好的穿过细胞膜的 能力。
[0022] 本发明还提供用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗组合物，其含有靶向 脂肪细胞的序列、九聚精氨酸（R9)肽、和作为活性成分的用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢 综合征的靶向脂肪细胞的治疗基因。用于治疗肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因可 以是DNA或iRNA，如siRNA或shRNA。
[0023] 本发明的ATS-R9与脂肪组织脉管系统中的阻抑素结合，之后内化到脂肪细胞中。 简言之，本发明的ATS-R9通过阻抑素靶向成熟脂肪组织脉管系统并与成熟脂肪组织脉管 系统结合，穿过血管，并内化到脂肪细胞中。因此，本发明的ATS-R9特异性地靶向脂肪细 胞，特别是其中大量表达阻抑素的已分化的成熟肥胖脂肪细胞，使得其可以将期望的基因 递送至脂肪细胞。
[0024] 本发明的靶向脂肪细胞的非病毒基因递送体系具有期望基因的高转染效率、低细 胞毒性和高表达效率。由于这些优势，本发明的基因递送体系在期望基因的递送中是有效 的。
[0025] 本发明的效果
[0026] 本发明的ATS-R9肽结构能够通过阻抑素在分化后的脂肪细胞中的过表达的机制 直接靶向成熟肥胖脂肪细胞，以将基因递送到脂肪细胞。因为该特异性功能和效果，本发明 的ATS-R9肽结构在用于肥胖的基因治疗中会非常有用。
【附图说明】
[0027] 图1是示出通过本发明的ATS-R9寡肽复合物将靶向基因递送至脂肪细胞的机制 的示意图。
[0028] 图2示出根据脂肪细胞分化程度的关于3T3-L1脂肪细胞的定量分析和油红0染 色的结果。
[0029] 图3和4示出ATS-R9的时间依赖的细胞内分布（内化）以证明ATS-R9对脂肪细 胞的特异性结合亲和力。
[0030] 图5示出根据3T3-L1脂肪细胞分化程度的阻抑素的分布。
[0031] 图6将通过蛋白质印迹确定的非肥胖小鼠中阻抑素和肌细胞的表达与肥胖小鼠 中阻抑素和肌细胞的表达进行比较。
[0032] 图7示出ATS-R9浓缩和保护DNA的能力的凝胶阻滞分析和小鼠血清中DNA降解 的测试的结果。
[0033] 图8示出ATS-R9/DNA寡肽复合物的ζ电势和平均直径。
[0034] 图9示出细胞活性分析的结果以评价ATS-R9/DNA寡肽复合物的毒性。
[0035] 图10示出寡肽复合物的转染效率。
[0036] 图11示出使用食源性肥胖（DI0)小鼠的情况下ATS-R9对脂肪组织的靶向效果。
[0037] 图12和13将ATS-R9的体内归巢能力与R9的体内归巢能力进行比较。
[0038] 图14示出ATS-R9的体内基因表达效果。
[0039] 图15示出ATS-R9在体外和体内递送sh-RNA和沉默基因的能力。
[0040] 图16示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理后体重的减少。
[0041] 图17和18示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽复合物处理后胰岛素和葡萄糖耐受性 的改变。
[0042] 图19示出比较ATS-R9递送基因的能力与作为对照的PEI和lipofectamine递送 基因的能力的图。
[0043] 图20是比较在脂肪细胞分化之前和之后ATS-R9的基因递送效力的图。
[0044] 实施发明的最佳方式
[0045] 本文中所使用的术语的定义如下。
[0046] "基因"意思是在编码或转录蛋白质、或者调节其他基因表达中具有功能作用的任 何核酸序列或其部分。基因可以由负责编码功能性蛋白质的全部核酸或者负责编码或表达 蛋白质的核酸的仅一部分组成。核酸序列可以包含在外显子、内含子、起始区域或终止区 域、启动子序列、其他调节序列或基因的独特相邻区域内的基因异常。
[0047] 术语"多核苷酸"或"核酸"是指任意长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸 以及核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构，因此包括双链和单链的DNA和RNA。其还包 括已知的修饰类型，例如现有技术中已知的标记、甲基化、"帽"、用类似物取代一种或更多 种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰如利用不带电荷的连结（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷 酰胺酯、氨基甲酸酯等）和利用带电荷的连结（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的那些 修饰、含侧基团例如蛋白质（包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等）的 那些、利用嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的那些、含有螯合物（例如金属、放射性金属、 硼、氧化性金属等）的那些、含有烷化剂的那些、利用修饰连接（例如α异头核酸等）的那 些，以及未修饰形式的多核苷酸。一般地，本发明提供的核酸片段可以由基因组的片段和短 的寡核苷酸连接子、或由一系列寡核苷酸、或由单个核苷酸组成，以提供能够在包括来源于 微生物或病毒操纵子、或真核基因的调控因子的重组转录单元中表达的合成核酸。
[0048] 术语"载体"是指能够将另一种核酸输送到其已经连接的核酸的核酸分子。术语 "表达载体"意在包括质粒、黏粒或噬菌体，其可以合成由载体携带的重组基因编码的神经 突蛋白（Neuritin，CPG15)。优选的载体是可以自我复制并表达与其结合的核酸的载体。
[0049] "转染"意思是以下这种方法：通过该方法，将核酸（例如DNA或RNA)直接引入到 动物培养细胞以表达其基因特性。当目标是植物细胞时，在许多情况下将细胞壁去除并将 核酸引入到原生质体。该方法使得能够研究医学科学和生物学中的许多问题，例如在细胞 水平上的致癌机制、感染、免疫、生成和信息递送。一般地，将期望的基因包含在运载体如质 粒中，并引入到核酸中。在许多情况下，当在细胞中稳定化时将引入的基因插入到染色体 中。已经将核酸引入到其中的细胞被称为"转导体"。已经开发数个方法来克服低转导效率 的问题。这种方法的实例包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖处理、电穿孔和重分配（称作脂 质体的人工膜与细胞的融合以用于DNA络合）。
[0050] "ζ电势"意思是由在结合至带电颗粒表面的固定水与可从颗粒容易地分开的可 移动水的扩散双层中正电荷的密度梯度引起的电动电势。ζ电势也表示为细胞表面与周围 培养流体之间的电势差。
[0051] 在用作基因递送体系的复合物中术语"电荷比"意思是当带负电的DNA与带正