高效分泌前列腺素e2（pge2）的重组间充质干细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及高效分泌前列腺素E2 (PGE2)的重组间充质干细胞及其应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且 已从骨髓、脂肪组织、厮带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs具有强大的自我更新能力和多向 分化潜能，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞；同时，MSCs是一种重要的免疫调节 细胞，MSCs在炎症细胞因子刺激后对免疫系统表现出很强的抑制作用，所WMSCs应用于减 少免疫排斥，延长移植物存活时间，治疗相关免疫失调症，如自身免疫疾病等方面。MSCs在 炎症因子刺激下能够分泌大量的趋化因子和具有免疫抑制特性的前列腺素E2 (PGE2)。在趋 化因子的作用下，免疫细胞被趋化到MSCs周围并被其局部高浓度的PGE2所抑制。
[0003]PGE2是一种重要的调控分子，通常与iNOS或者IDO等其它免疫调节因子协同 作用，抑制免疫细胞的增殖W及炎性因子的产生。Mysml是M孔-1化e，SWIRMandMPN domain-containingprotein-l的缩写，又称为 2A-DUB，或者KIAA1915/MYSM1，是组蛋白 肥A去泛素化酶之一。Mysml可W特异性的调节组蛋白肥A的单泛素化，从而改变组蛋白修 饰，进而影响基因的转录。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供在炎症因子刺激下能够高效分泌前列腺素E2 的重组间充质干细胞的应用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组间充质干细胞在制备抑制T细胞增 殖的产品和/或免疫抑制剂中的应用。
[0006] 本发明所提供的重组间充质干细胞在制备抑制T细胞增殖的产品和/或免疫抑 制剂中的应用中，所述重组间充质干细胞按照如下方法制备：降低受体间充质干细胞中 Mysml基因的表达量，得到重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干 细胞；所述Mysml为组蛋白肥A去泛素化酶。
[0007] 上述应用中，所述重组间充质干细胞具有下述1)-6)中至少一种特性：
[0008] 1)所述重组间充质干细胞的增殖能力高于所述受体间充质干细胞；
[0009] 2)所述重组间充质干细胞的分化能力高于所述受体间充质干细胞；
[0010] 3)所述重组间充质干细胞的成骨标志基因RUNX2的表达能力高于所述受体间充 质干细胞；
[0011] 4)所述重组间充质干细胞的成脂标志基因PPAR丫的表达能力高于所述受体间充 质干细胞；
[0012] 5)所述重组间充质干细胞的前列腺素E2分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
[0013] 6)所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
[0014] 上述应用中，所述免疫抑制能力可为抑制T细胞增殖的能力，具体可为抑制CD3+T 细胞增殖的能力。
[0015] 本发明的重组间充质干细胞与所述受体间充质干细胞相比，所述Mysml基因的表 达量降低；所述Mysml基因的表达量可W为Mysml基因的mRNA水平。
[0016] 上述应用中，所述Mysml是氨基酸序列为SEQIDNo. 1的蛋白质。SEQIDNo. 1由 819个氨基酸组成。
[0017] 上述应用中，所述Mysml基因为编码SEQIDNo. 1所示蛋白质的基因，其CDNA序 列为沈QIDNo. 2所示。
[0018] 上述应用中，所述降低受体间充质干细胞中Mysml基因的表达量包括向受体间充 质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中所述MySm1基因表达的物质。
[0019] 上述应用中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因表达的物质为下 述1)-10)中任一种生物材料：
[0020] 1)shRNA，是形成茎环结构的短发夹RNA;
[0021] 2)表达1)所述的ShRNA的表达载体；
[0022] 3)表达1)所述的ShRNA的重组微生物细胞；
[0023] 4)表达1)所述的ShRNA的重组动物细胞； W24]W表达1)所述的ShRNA的重组植物细胞； 阳0巧]6) 1)所述ShRNA产生的SiRNA;
[0026] 7)表达6)所述SiRNA的表达载体；
[0027] 8)表达6)所述SiRNA的重组微生物细胞； 阳02引 9)表达6)所述SiRNA的重组动物细胞；
[0029] 10)表达6)所述SiRNA的重组植物细胞。
[0030] 上述应用中，所述生物材料中1)所述的ShRNA的核巧酸序列是SEQIDNo. 3。
[0031] 上述应用中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysml基因表达的物质可为 表达所述shRNA的重组慢病毒LV-shmMysml。
[0032] 上述应用中，所述重组慢病毒LV-ShmMysml与所述受体间充质干细胞共培养，抑 制所述受体间充质干细胞中Mysml基因的表达。
[0033] 上述应用中，所述重组慢病毒LV-ShmMysml按照如下方法制备：将表达SEQID No. 3所示的shRNA的重组质粒、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G共转染哺 乳动物细胞，培养细胞后得到所述重组慢病毒。
[0034] 上述应用中，所述表达沈QIDNo. 3所示的ShRNA的重组质粒具体可为质粒 pLKO. 1-shmMysml。 阳03引上述应用中，所述哺乳动物细胞具体可为293T/17细胞
[0036]上述应用中，所述重组慢病毒的感染剂量MOI可为巧-40)，具体可为5。
[0037] 上文中，所述离体的间充质干细胞可为哺乳动物的离体的间充质干细胞，具体可 为小鼠的离体的间充质干细胞（胚胎间充质干细胞或骨髓间充质干细胞）。
[0038] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Bl或B2的产品：
[0039] B1、抑制T细胞增殖的产品，其活性成分为所述重组间充质干细胞；
[0040] B2、免疫抑制剂，其活性成分为所述重组间充质干细胞。
[0041] 上文中，所述T细胞具体可为CD3巧细胞。
[00创实验证明，本发明所得到的重组间充质干细胞C3-shM细胞分泌PGE2能力强，从而 抑制CD3巧增殖的能力增强。在TNF-Q和IFN-丫的刺激下，诱导培养的C3-shM细胞中PGE2 基因表达水平显著升高，是诱导培养的C3-G细胞中PGE2基因表达水平的5倍；在非诱导培 养和诱导培养条件下，C3-shM细胞分泌PEG2的水平均明显高于C3-G细胞和C3H/10T1/2 细胞，C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分泌阳G2的水平相当。C3-shM细胞对CD3巧细胞的 增殖抑制能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞对 CD3巧细胞的增殖抑制能力相当。当C3-shM细胞与CD3巧细胞的数量比为1:10时，CD3+T 细胞的增殖率只有33. 2%，强于相同条件下C3-G细胞巧7. 7% )对CD3+T细胞增殖抑制能 力；单纯CD3+T细胞的增殖率为85. 7%。WC3H/10T1/2细胞中Mysml基因的mRNA相对于 0 -actin基因的mRNA表达量为1，C3-G细胞中Mysml基因的mRNA相对于0 -actin基因的 mRNA表达量为0. 96,C3-shM细胞中Mysml基因的mRNA相对于0 -actin基因的mRNA表达 量为0. 56。C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的增殖能力相当，C3-shM细胞的增殖能力明显强 于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3-shM细胞的化加阳性细胞比例为24. 1 %，C3-G细胞 的化加阳性细胞比例为15. 3%。C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2的表达量和成脂相关 基因PPAR丫的表达量均明显高于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，WC3-G细胞中成骨相关 基因RUNX2相对0 -actin的表达量为l，C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2相对0-actin 的表达量为23 C3-G细