瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体设及瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿 瘤联合用药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着肿瘤分子生物学的发展，肿瘤的化疗进入分子祀向治疗时代，针对分子祀点 的新一代抗肿瘤药物将凭借其特异性和祀向性，成为肿瘤治疗的另一主要方向。多祀点抑 制剂在治疗方面优于单祀点抑制剂，多祀点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发新的 发展方向。
[0003] 联合用药是近年来肿瘤化疗领域的热点之一，大量的临床和实验研究证明，联合 药物疗法在肿瘤的防治和康复方面有特效。其与传统的单药治疗相比具有多种优点，如可 W同时祀向多种重要信号通路、克服肿瘤耐药、降低毒副作用等。
[0004] 酪氨酸激酶受体家族是肿瘤治疗较理想的特异性祀点，赋予了酪氨酸激酶抑制剂 灯KIs)的关键作用。TKIs可通过下调肿瘤细胞的血管生成因子W及抑制EGFR对肿瘤血管 内皮细胞的信号传导，EGFR和血管内皮生长因子受体（VEGFR)两种信号传导通路的"交叉 对话"，为临床同时抑制运两种传导通路提供了合理的依据。
[0005] 瑞格替尼（Regorafenib)可广泛抑制与血管生成和肿瘤发生相关的祀激酶，如 VEGFR、TIE-2 和Ret、PDGFR- 0、c-Kit、C-Raf、bFGFR-1W及p38 等，从而发挥抗肿瘤作用。 除此之外，Regorafenib对酪氨酸蛋白激酶孤R2、Trk2A、E地2A、RAF-1、BRAFV600E、SAPK2、 PTK5、Abl等多个激酶都有很强的抑制作用，由于其广谱的激酶抑制活性，对该药在除了转 移性直肠癌及胃肠道间质瘤W外的适应症的研究也在广泛开展。拉帕替尼是一种口服的小 分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂，是一种可逆性EGFR和肥R-2双受体阻断剂，2007年 5月通过了美国FDA的审批，临床适应症是已接受过蔥环类、紫杉类和transtuzum油治疗转 移或侵袭性的肥R-2过表达的乳癌患者。
[0006] 目前，尚没有瑞格替尼和拉帕替尼联合使用的相关文献报道。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供瑞格替尼和拉 帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤联合用药物。
[0009] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0010] 瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用；
[0011] 所述的瑞格替尼和拉帕替尼的用量摩尔比优选为（0.001:1)~（1:1);
[0012] 所述的瑞格替尼的有效剂量优选为50mg/kg，拉帕替尼的有效剂量优选为IOOmg/ kg；
[0013]所述的肿瘤优选为结直肠癌肿瘤；
[0014] 一种抗肿瘤联合用药物，包含瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐，W及 瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互 变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物；
[0015] 所述的抗肿瘤联合用药物还可W含有一种或者是至少两种药学上可W接受的载 体；
[0016] 所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、 吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
[0017] 所述的抗肿瘤联合用药物可W进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊等多种形式， 各种剂型的药物可W按照药学领域的常规方法制备；
[0018] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼的联合用药可显著的引起肿瘤细胞周期阻滞 作用，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制结直肠癌的进展。
[0019] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼的联合用药可有效地提高对肿瘤细胞的杀伤 能力，能极大促进肿瘤细胞调亡的发生。
[0020] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用，指可通过 抑制肥T116、HT29、SW620和肥T8等不同的结直肠癌肿瘤细胞的生长W达到治疗肿瘤的作 用巧W引起HCT116和SW620细胞周期阻滞，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制肿瘤细胞增 殖；可W引起HCT116和SW620细胞发生调亡，从而抑制肿瘤细胞增殖；本发明所述瑞格替 尼和拉帕替尼联合用药可W抑制裸鼠移植瘤生长，裸鼠血清中药物浓度测定显示瑞格替尼 和拉帕替尼代谢无括抗相互影响作用。
[0021] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0022] (1)瑞格替尼和拉帕替尼联合用药，在本发明的用量比例范围内，两者具有明显的 协同作用，有效提高疗效，相对于单一组分或两组分简单疗效叠加更显著，提高了对肿瘤细 胞的杀伤性。
[002引 似在保证同样治疗效果的情况下，瑞格替尼和拉帕替尼的联合使用可W降低彼 此的用药量，从而减少毒副作用。
[0024] (3)瑞格替尼和拉帕替尼的联合使用也可节约成本，减轻病人的经济负担，本发明 为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。
【附图说明】
[0025] 图1是MT方法检测不同肿瘤细胞在瑞格替尼或拉帕替尼单独处理后的存活率结 果分析图；其中，A:瑞格替尼处理后结果分析；B:拉帕替尼处理后结果分析。
[0026] 图2是MTT方法检测结直肠癌细胞肥T116和SW620经瑞格替尼和拉帕替尼单独处 理及联合处理后细胞的存活率结果分析图；其中，A:细胞HCT116结果分析；B:细胞SW620 结果分析。
[0027] 图3是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后 结直肠癌细胞HCT116的细胞周期分布结果分析图。
[0028] 图4是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后 结直肠癌细胞SW620的细胞周期分布结果分析图。
[0029] 图5是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后 结直肠癌细胞HCT116的细胞调亡检测结果分析图。
[0030] 图6是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后 结直肠癌细胞SW620的细胞调亡检测结果分析图。
[0031] 图7是利用WesternBlot法评价经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处 理后结直肠癌细胞HCT116和SW620细胞内细胞周期相关蛋白和调亡蛋白的影响结果分析 图；其中，A:细胞肥T116结果分析；B:细胞SW620结果分析。
[0032] 图8是在裸鼠动物中，瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠移植瘤体 积的生长曲线及瘤重结果分析图。
[0033] 图9是在裸鼠动物中，瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠血清中血 药的浓度曲线结果分析图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[003引本发明实施例使用的所有细胞株均来源于ATCC，本发明使用的瑞格替尼和拉帕替 尼购于ApexBio公司。
[0036] 实施例IMTT法检测不同肿瘤细胞对瑞格替尼或拉帕替尼的敏感性
[0037] 将人结直肠癌细胞肥T116、SW620、HT29和肥T8细胞W每孔5000~9000个细胞 的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的瑞格替尼或拉帕替尼的PBS溶 液。培养7化后，每孔加入10yL浓度为5mg/mL的MTT再培养地，然后弃培养液每孔加入 100yL的DMS0,用酶标仪在490nm读取每孔的吸光值。用Bliss法计算半数抑制浓度值 (IC50)。具体结果见图1。
[003引从图1可W看出，瑞格替尼和拉帕替尼对不同的肿瘤细胞的IC50值都处在一个比 较小的范围内，其中瑞格替尼对不同的肿瘤细胞的IC50值在15~25yM范围内，而拉帕替 尼对不同的肿瘤细胞的IC50值在10~70yM范围内。表明瑞格替尼和拉帕替尼对不同的 肿瘤细胞都具有较好的抑制增殖作用。
[0039] 实施例2瑞格替尼或拉帕替尼单独使用W及联合使用后对不同肿瘤细胞存活率 的影响
[0040] 将人结直肠癌细胞肥Tl16和SW620细胞W每孔5000~9000个细胞的数量接种到 96孔板，待细胞贴壁后，加入不同的瑞格替尼和拉帕替尼的配比的PBS溶液。培养7化后，每 孔加入10yL浓度为5mg/mL的MlT再培养地，然后弃培养液每孔加入100yL的DMS0,用酶 标仪在490皿读取每孔的吸光值。用CompuSyn软件进行协同作用综合因子（Combination index,Cl)分析。结果见图2和表1，图2表明经不同药物浓度联合处理后肥T116和SW620 的细胞存活率。
[0041] CI值表示药物联合作用时的一个复合指数，CI值小于、等于和大于1分别表示药 物具有协同作用、增效作用和括抗作用。从表1可W看出，瑞格替尼和拉帕替尼对不同的肿 瘤细胞联合使用时，其CI值基本都在小于1的范围内，表示瑞格替尼和拉帕替尼在本发明 的用量范围内联合使用具有很好的协同作用。
[004引表1瑞格替尼和拉帕替尼联合作用肥Tl16和SW620的CI值
[0044] 实施例3瑞格替尼和拉帕替尼单独及联合使用后对肥Tl16和SW620细胞的细胞 周期的影响
[0045] 用流式细胞术检测瑞格替尼和拉帕替尼单独使用及它们联合使用后引起结直肠 癌细胞肥T116和SW620的细胞周期阻滞情况。先将肥T116和SW620细胞分别W每孔 3XIO5个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，再将肥T116和SW620细胞各分为四 个实验组，分别加入下列溶液：第一组为对照组不处理；第二组为瑞格替尼单独处理组（浓 度为3yM，10yM，30yMS个梯度）；第S组为拉帕替尼单独处理组（浓度为3yM，10yM， 30iiMS个梯度）；第四组为瑞格替尼和拉帕替尼联合处理组（联合用药浓度为瑞格替尼 10yM+拉帕替尼10yM)。共同处理4化后，用膜酶消化的办法收获运些细胞，1000转离屯、 5min，去掉上清，后分别用带血清的培养基和憐酸盐缓冲液（PB巧清洗一次。加入体积分数 为70%的乙醇冰上固定化，1000转离屯、5min，去掉上清，PBS清洗一次后加入200yL舰化 丙锭（PI)染色液室溫避光反应30min，样品随后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
[004引结果如图3和图4所示，瑞格替尼（10yM)和拉帕替尼（10yM)单独处理肥T116 和SW620细胞时，其G0/G1期细胞较对照组相比有一定的增加。而用瑞格替尼（IOyM)和 拉帕替尼（10yM)联合处理肥T116和SW620细胞后，肥T1