含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有2-0-a-D-葡萄糖基-k抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法 和用途，更具体地，涉及与已有物相比显著更难W固结的含有2-0-a-D-葡萄糖基-k抗坏 血酸无水结晶的粉末及其制造方法，W及W其作为食品原料、化妆品原料、准药品原料、药 品原料的用途。
【背景技术】
[0002] 由于k抗坏血酸具有优异的生理活性及抗氧化作用，一直W来用于包括食品、化 妆品等的多种用途中。但是，k抗坏血酸则由于具有直接还原性的原因而不稳定，存在易 于氧化分解、易于丧失生理活性的较大的缺点。为了消除心抗坏血酸的缺点，本申请人作 为共同申请人中的一人在专利文件1中公开了在k抗坏血酸的2位居基上结合了 1分子 的D-葡萄糖得到2-0-a-D-葡萄糖基-k抗坏血酸（W下在本说明书中简称为"抗坏血酸 2-葡萄糖巧"）。送种抗坏血酸2-葡萄糖巧不具有直接还原性，很稳定，并且，具有在生物 体内原本存在的酶的作用下分解为k抗坏血酸和D-葡萄糖，发挥k抗坏血酸原本的生理 活性的划时代的特性。根据专利文献1公开的制造方法，含有k抗坏血酸和a-葡萄糖基 糖化合物的溶液在环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶（W下简称为"CGT酶"）或a-葡萄糖巧酶 等的糖转移酶作用下生成抗坏血酸2-葡萄糖巧。
[0003] 此外，本申请人在专利文献2中公开了从抗坏血酸2-葡萄糖巧的过饱和溶液中成 功析出抗坏血酸2-葡萄糖巧的晶体，得到抗坏血酸2-葡萄糖巧W及包含抗坏血酸2-葡萄 糖巧的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧结晶的粉末。并且，现阶段认为抗坏血酸2-葡萄糖巧结 晶仅存在无水结晶物。因此，在非专利文献1及2中，报道了用X射线解析抗坏血酸2-葡 萄糖巧结晶的结构的结果。
[0004] 此外，本申请人在专利文献3及4中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖巧的物 质的制造方法，其将含有酶反应生成的抗坏血酸2-葡萄糖巧的溶液进行使用强酸性阳离 子交换树脂的柱层析获得高喊抗坏血酸2-葡萄糖巧的级分。此外，本申请人在专利文献5 中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖巧的物质的制造方法，将含有酶反应生成的抗坏血 酸2-葡萄糖巧的溶液中用阴离子交换膜的电透析法除去k抗坏血酸或糖类等夹杂物；在 专利文献6中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖巧的物质的制造方法，将含有抗坏血酸 2-葡萄糖巧的溶液接触阴离子交换树脂，可选择性除去阴离子交换树脂吸附的成分，得到 高含抗坏血酸2-葡萄糖巧的级分。
[0005] 此外，本申请人在专利文献7中公开了一种抗坏血酸2-葡萄糖巧的制造方法，含 有心抗坏血酸与a-葡萄糖基糖化合物的溶液在a-异麦芽糖基葡萄糖（异麦芽糖基葡 萄糖）生成酶、或a-异麦芽糖基葡萄糖生成酶与CGT酶的作用下生成抗坏血酸2-葡萄 糖巧。此外，本申请人在专利文献8及9中还分别公开了a-异麦芽糖基葡萄糖生成酶及 a-异麦芽糖基转移酶催化向k抗坏血酸的糖转移，生成抗坏血酸2-葡萄糖巧。
[0006] 同时，关于抗坏血酸2-葡萄糖巧的用途，例如专利文献10~29中示出了多种建 议。由于抗坏血酸2-葡萄糖巧具有的送些优异的特性，可用作食品原料、化妆品原料、准药 品原料或药品原料，与之前的k抗坏血酸的用途相比，广泛使用在W往由于k抗坏血酸不 稳定而不能将k抗坏血酸进行使用的其它用途。
[0007] 由上述内容可知，目前已知Wk抗坏血酸和淀粉为原料利用多种糖转移酶可制 得抗坏血酸2-葡萄糖巧。然而，如果本申请人根据目前已知的知识，将认为用作为糖转移 酶的CGT酶来作用含有k抗坏血酸和淀粉的溶液的方法是抗坏血酸2-葡萄糖巧的生成率 最高、可W成为工业上优选的方法。基于送种认识，本申请人根据用CGT酶作用于含有心抗 坏血酸和淀粉的溶液的方法制造含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，将其作为化 妆品?准药品原料W及食品原料，分别W商品名"AA2G"(株式会社林原生物化学研究所出 售）W及商品名'' 7ス3 7k'文シ二，，（株式会社林原商社出售）进行出售（下文中，送些 作为化妆品?准药品原料W及食品原料出出售的现有的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结 晶的粉末简称为"准药品级的粉末"）。
[0008] 然而，准药品级的粉末是在制品规格上，抗坏血酸2-葡萄糖巧的纯度在98. 0质 量％W上的较高纯度的产品，尽管刚制得的粉末具有良好的流动性，但长期搁置于高温、高 湿度的环境下时将由于自重W及吸湿出现固结的缺点。鉴于送种缺点，将准药品级的粉末 各IOkg装入聚己帰制的袋子中，与干燥剂一起装入附有盖子的钢制罐中作为商品形态进 行销售。但根据本发明人随后得到的认识，即使是送种商品形态的准药品级粉末在长期的 保存期间也通常出现固结，出现损坏粉末有效性的问题。一旦用作化妆品原料及准药品原 料或食品原料的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末出现固结，对原来W原材料是 具有流动性的粉末为前提设计的制造设备来说将在原材料输送、筛分、混合等步骤上出现 障碍。
[000引【现有技术文献】
[0010] 【专利文献】
[0011] 【专利文献1】特开平3-139288号公报
[0012] 【专利文献2】特开平3-135992号公报
[0013] 【专利文献3】特开平3-183492号公报
[0014] 【专利文献4】特开平5-117290号公报
[0015] 【专利文献5】特开平5-208991号公报
[0016] 【专利文献6】特开2002-088095号公报
[0017] 【专利文献7】特开2004-065098号公报
[001引【专利文献8】国际公开W002010361号单行本
[0019] 【专利文献9】国际公开W001090338号单行本
[0020] 【专利文献10】国际公开W005087182号单行本
[0021] 【专利文献11】特开平4-046112号公报
[0022] 【专利文献12】特开平4-182412号公报
[0023] 【专利文献13】特开平4-182413号公报
[0024] 【专利文献14】特开平4-182419号公报 [00巧]【专利文献15】特开平4-182415号公报
[0026]【专利文献16】特开平4-182414号公报
[0027]【专利文献17】特开平8-333260号公报
[0028]【专利文献18】特开2005-239653号公报
[0029]【专利文献19】国际公开W006033412号单行本
[0030] 【专利文献20】特开2002-326924号公报
[0031] 【专利文献21】特开2003-171290号公报
[0032]【专利文献22】特开2004-217597号公报
[0033]【专利文献23】国际公开W005034938号单行本
[0034]【专利文献24】特开2006-225327号公报
[0035] 【专利文献25】国际公开W006137129号单行本
[0036]【专利文献26】国际公开W006022174号单行本
[0037]【专利文献27】特开2007-063177号公报
[0038]【专利文献28】国际公开W006132310号单行本
[0039]【专利文献29】国际公开W007086327号单行本
[0040]【非专利文献】
[0041]【非专利文献1】7シ少^ ?夕力b 3等，「力一乐/W K k-h.U寸一于」（碳 水化合物研究），第232卷，197-205页（1992年）
[0042]【非专利文献^勺王?二夕力等，Mシ夕一十古3十沁.女^一十沁?才 万' .7 7 一 7古二一，^夕义」（国际制药学期刊），第331卷，38-45页（2007年）
【发明内容】
[0043] 发明解决的课题
[0044] 为了解决上述缺点，本发明的要解决的技术问题是提供一种含有抗坏血酸2-葡 萄糖巧无水结晶的粉末及其制造方法和用途，该粉末要比常用的准药品级的含有抗坏血酸 2-葡萄糖巧无水结晶的粉末显著更难W固结。
[0045] 解决课题的技术手段
[0046] 为了解决上述课题，本发明人反复研究含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉 末的固结性，本申请人发现作为分析用标准试剂销售的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结 晶的粉末（商品名"抗坏血酸2-葡萄糖巧999"，代码编号；AG124,株式会社林原生物化学 研究所销售）（W下简称"试剂级的粉末"）即使在准药品级的粉末固结的条件下仍不固 结，得W保持粉末的形状。送种试剂级的粉末与准药品级的粉末相同，均是经过CGT酶作用 于含有k抗坏血酸和淀粉的溶液的步骤、纯化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的溶液、 浓缩、析出抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶、收集结晶制得的粉末，但与准药品级的粉末所 不同的，在通常的步骤中还加入了将一次得到的结晶溶解后再次析出晶体的再结晶步骤、 W及将再结晶步骤得到的结晶用经纯化水等反复洗净的洗净步骤，由此可W得到抗坏血酸 2-葡萄糖巧纯度在99. 9质量％W上的纯度极高级水平的粉末。因此，推测如果准药品级的 粉末中抗坏血酸2-葡萄糖巧纯度提高至99. 9质量％ ^上，是否也可W得到难W固结的含 有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末。
[0047] 然而，为了使抗坏血酸2-葡萄糖巧的纯度达到为99. 9质量％W上的高纯度，如上 所述，在常规的制造步骤中必须加入再结晶步骤W及反复用经纯化水等洗净的步骤，送样 不仅将增加制造所花费的时间和劳力，并且在再结晶步骤及洗净步骤中还无法避免抗坏血 酸2-葡萄糖巧的损失，导致出现制品成品率低下、制造成本大幅上升的缺点。因此，为了得 到比准药品级的粉末更难W固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末的目的，单 纯地将抗坏血酸2-葡萄糖巧的纯度提高到99. 9质量％W上的选择项是不现实的。
[0048] 因而，本发明人着重研究了含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末的固结性， 重复了多种尝试错误的结果，发现尽管含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的无水结晶的粉末中抗 坏血酸2-葡萄糖巧的纯度与之前的准药品级的粉末水平相同；或者，即使没有达到试剂级 的纯度水平，只要使含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖巧无 水结晶的结晶度也达到90%W上；或者，粉末的动态水分吸附量为0.Ol质量％ ^下，则该 粉末就比准药品级的粉末显著更难W固结。
[0049] 此外，本发明人进一步研究了结晶度及动态水分吸附量达到上述水平的含有抗坏 血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末的工业规模的制造方法，结果发现，含有k抗坏血酸与淀 粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下，溶液中能按35质量％ ^上的高生成率生 成抗坏血酸2-葡萄糖巧，纯化该溶液，直至溶液中抗坏血酸2-葡萄糖巧的含量按无水物换 算时超过86质量％时，从该溶液中析出含抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，可W较 为容易地获得结晶度在90%W上、粉末的动态水分吸附量为0.Ol质量％W下的抗坏血酸 2-葡萄糖巧无水结晶。
[0050] 此外，本发明人发现，含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的结晶度90%W上或动 态水分吸附量0.Ol质量％W下的抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末与之前的准药品级 粉末相比显著更难W固结，易于用作食品原料、化妆品原料、准药品原料W及药品原料，具 有重大意义和价值，由此完成本发明。
[0051] 目P，本发明提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，其特征是；按 无水物换算含有超过98. 0质量％不足99. 9质量％的抗坏血酸2-葡萄糖巧，且基于粉末X 射线衍射曲线算出的抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的结晶度为90%W上，由此解决了上 述课题。
[0052] 此外，本发明提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，其特征是： 按无水物换算含有超过98. 0质量％不足99. 9质量％的抗坏血酸2-葡萄糖巧，且氮气流下 除去粉末中的水分后，在温度25C、相对湿度35质量％的条件下保持12小时时其动态水分 吸附量为0.Ol质量％ ^下，由此解决了上述课题。
[0053] 在优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末含有 占粉末全体70质量％W上的粒径不足150ym的粒子W及占粉末全体40~60质量％的 粒径53UmW上不足150Um的粒子。此外，在优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸 2-葡萄糖巧无水结晶的粉末含有k抗坏血酸和/或D-葡萄糖，且粉末全体的还原能力不 足1质量％。此外，在更优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶 的粉末中k抗坏血酸量按无水物换算为0. 1质量％W下。
[0054] 如上所述的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，典型的是从经 过CGT酶作用于含有k抗坏血酸和淀粉的溶液的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的 溶液制得的粉末。
[0055] 此外，本发明还提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末的制造方 法，其特征是包括；含有k抗坏血酸和淀粉的溶液经CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用，得 到抗坏血酸2-葡萄糖巧生成率35质量％W上的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的溶液的步骤； 纯化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的溶液，使抗坏血酸2-葡萄糖巧的含量按无水物换 算超过86质量％的步骤；从按无水物换算含有超过86质量％的抗坏血酸2-葡萄糖巧的溶 液中析出抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的步骤；收集析出的抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结 晶的步骤；对收集的抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶老化、干燥、根据需要而粉碎的步骤。
[0056] 在本发明的制造方法中使用的CGT酶只要能使含有k抗坏血酸和淀粉的溶液在 CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下能按照生成率35质量％W上的高生产率生成抗坏血 酸2-葡萄糖巧的酶，其起源和来源没有特别限制，可W是天然的酶，也可W是基因重组得 到的酶。但是，从抗坏血酸2-葡萄糖巧的生成率观点出发，优选下述的经基因重组技术变 异的来自嗜热脂肪±芽抱杆菌（GeobacillusStearothermo地ilus)Tc-62株的CGT酶、来 自嗜热脂肪±芽抱杆菌Tc-27株的CGT酶、或来自嗜热脂肪±芽抱杆菌Tc-91株的CGT酶 得到的变异CGT酶，其中，嗜热脂肪±芽抱杆菌Tc-62株产生的CGT酶由于能获得较高的抗 坏血酸2-葡萄糖巧的生成率，因此最为优选。
[0057] 使用的葡萄糖淀粉酶没有特别限制，只要能使含有k抗坏血酸和淀粉的溶液在 CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下能按照生成率35质量％W上的高生产率生成抗坏血 酸2-葡萄糖巧的酶即可，其起源和来源没有特别限制，可W是天然的酶，也可W是基因重 组得到的酶。
[0058] 也依赖于作为原料使用的淀粉的种类，也可W在含有k抗坏血酸和淀粉的溶液 经CGT酶作用时，使异淀粉酶或支链淀粉酶等淀粉脱支酶与CGT酶一同作用来提高抗坏血 酸2-葡萄糖巧生成率。
[0059] 且，在本发明的制造方法的优选的一种情况中，上述纯化含有抗坏血酸2-葡萄糖 巧的溶液至抗坏血酸2-葡萄糖巧含量按无水物换算超过86质量％的步骤中，将经过滤、脱 盐的酶反应液接触阴离子交换树脂，使其吸附抗坏血酸2-葡萄糖巧和k抗坏血酸，用经纯 化水洗脱除去D-葡萄糖等糖类后，向层析柱中加入不足0. 5N的盐酸或盐类的水溶液作为 洗脱液，洗脱抗坏血酸2-葡萄糖巧和k抗坏血酸，浓缩洗脱液，进行使用阳离子交换树脂 或多孔性合成树脂的柱层析，用洗脱液洗脱的方法。特别地，在用强酸性阳离子交换树脂为 填充剂的模拟移动床式作为使用阳离子交换树脂的柱层析时，能高效地、较好收率地获得 目的抗坏血酸2-葡萄糖巧的含量超过86质量％的级分，因此优选送种情况。
[0060] 在此之上，本发明还提供了包含本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的 粉末的粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料，由此解决了上述课题。
[0061] 本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末可有利地用于食品原料，所 述食品原料例如可分别举出：维生素C强化剂、胶原产生强化剂、美白剂、味道改善剂、品质 改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、抗氧化剂等；可有利地用于化妆品原料，所述 例如化妆品原料可分别举出；美白剂、细胞赋活剂、胶原产生强化剂、维生素C强化剂、味道 改善剂、品质改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、稳定剂、抗氧化剂等巧有利地 用于准药品原料，所述准药品原料例如可分别举出；美白剂、细胞赋活剂、胶原产生强化剂、 维生素C强化剂、味道改善剂、品质改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、稳定剂、 抗氧化剂等；W及，可有利地用于药品原料，所述药品原料例如可分别举出；美白剂、细胞 赋活剂、胶原产生强化剂、脏器保护剂、自由基障碍抑制剂、维生素C强化剂、防止黑变剂、 赋形剂、增量剂、稳定剂、抗氧化剂等。
[006引发明的效果
[0063] 由于与之前作为化妆品原料、准药品原料、食品原料等市售的准药品级粉末相比， 本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末显著更难W固结，因此在保存、保管时 及流通时粉末的流动性不容易收到影响，具有容易处置的优点。此外，尽管本发明的含有抗 坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末比之前的准药品级粉末显著更难W固结，但由于抗坏 血酸2-葡萄糖巧的纯度也没必要高至试剂级粉末的水平，因此制造时没必要增加再结晶 步骤和重复洗净结晶的步骤。因此，不会大幅降低制品的成品率，还具有可廉价地进行制造 的优点。
[0064] 同时，本发明的制造方法具有W下优点；通过使用本发明的制造方法，Wk抗坏 血酸和淀粉为原料，根据与之前的准药品级粉末的制造方法的步骤不发生变化的制造方法 也可制得本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末，只需要花费与之前准药品 级粉末的制造所必需的时间、劳动力、制造设备及成本相差不大的时间、劳动力、制造设备 及成本，即可制得比准药品级粉末显著更难W固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶 的粉末。
[0065] 此外，由本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末构成的粉末状的食 品原料、化妆品原料、准药品原料W及药品原料具有W下优点：由于构成粉末状原料的含 有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末显著更难W固结，因此在保存、保管方面容易处置 些，可使用W流动性粉末为原料为前提制作的制造设备，在原料的输送、筛分、混合等步骤 中不会出现障碍。
[0066] 同时，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末具有W下优点：由于容 易调整为食品原料等所希望的粒度分布，即，粒径不足150Um的粒子占粉末全体的70质 量％W上，且粒径53UmW上不足150Um的粒径占粉末全体的40~60质量％的粒径分 布，因此将其用作食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料无需改变之前的制造过程 和原料规格，可直接使用从前的方法。此外，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶 的粉末还具有W下优点；当含有k抗坏血酸和/或D-葡萄糖且粉末全体的还原能力不足 1质量％时，尽管是^k抗坏血酸和淀粉为原料制得的粉末，但即使混合氨基酸及蛋白质 等分子内具有氨基的其他成分也不会出现变色等品质降低的现象。更具体地，当本发明的 含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末中k抗坏血酸含量按无水物换算为0. 1质量％ W下时，即使将本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉末作为单独粉末长时间 保存，粉末自身也不会出现淡褐色的着色，可作为实质上无着色的白色粉末用作食品原料、 化妆品原料、准药品原料及药品原料。
【附图说明】
[0067] 【图1】依据基本上由抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄 糖巧无水结晶的粉末的特性X射线得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
[0068] 【图2】依据基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧的粉末的特性 X射线得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
[0069]【图3】依据基本上由抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄 糖巧无水结晶的粉末的同步加速器福射得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
[0070]【图4】依据基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的粉 末的同步加速器福射得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
[0071] 【图5】示出了来自属于±芽抱杆菌属的微生物的CGT酶的高级结构的模式图。 [007引【图6】示出了来自属于±芽抱杆菌属的微生物的CGT酶的催化剂残基及保守区域 的模式图。
[0073]【图7】示出了本发明使用的包含来自属于±芽抱杆菌属的微生物的CGT酶基因的 重组DNA"pRSET-iBTC12"的结构及限制性切酶位点的图。
【具体实施方式】
[0074] 1.措辞的定义
[00巧]本说明书中下述措辞具有W下含义。
[007引 < 结晶度〉
[0077] 本说明书中的"关于抗坏血酸2-葡萄糖巧无水结晶的结晶度"指的是