一种叶酸标记的荧光二氧化硅包裹金纳米粒子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于荧光/CT双模成像纳米制剂的制备方法，进一步涉及结合卟啉物TCPP和叶酸的多功能纳米粒子作为荧光探针及CT成像造影剂在生物医学领域的应用。
【背景技术】
[0002]CT成像是利用不同的组织或器官由于自身不同的密度与厚度，对X射线产生不同程度的衰减作用，形成不同组织或器官的灰阶影像对比分布图，从而以病灶的相对位置、形状和大小等的改变来判断病情的医学成像方法。CT成像技术具有空间分辨率高、图像采集时间短、可整体成像的优点，是一种最为普遍的疾病诊断成像模式。但是，CT成像技术也存在一些不足之处亟需解决，如对软组织分辨率差、检测过程中存在放射性辐射等问题。这就需要使用CT造影剂来提高病灶部位的分辨率，目前临床上使用的CT造影剂主要是含碘小分子化合物，例如泛影酸和碘海醇等。人体肾脏对含碘小分子化合物有快速清理效应，所以这种造影剂的成像时间很短，并且它对肾脏还有一定的毒副作用。基于纳米颗粒的CT造影剂能够解决上述问题，它能够有效地延长成像时间，对于肾脏的毒副作用小，并且造影效果好。
[0003]荧光成像是一种直观、原位的可视化观测技术，用于检测肿瘤以及对细胞核药物进行示踪。和其他成像相比，它更加便宜、更加安全并且能够在短暂光照下快速成像。这些优势使其能够在手术过程中便于识别肿瘤，对治疗过程进行实时监控。但是由于光散射，体内黑色素、血红蛋白和水等对光的吸收，组织自发光形成背景干扰，导致利用紫外可见光的荧光成像对组织的穿透性差，成像信号的信噪比降低，从而获取的图像仅能到达表皮下几十微米，而且并不清晰。基于近红外纳米探针的荧光成像技术能够获取更深层更清晰的活体荧光图像，具有背景干扰低、对细胞损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等优点，显示了较好应用前景。
[0004]近几年来，纳米水平的金粒子在生物医学应用方面得到了越来越多的关注。金纳米粒子的颜色变化取决于它的大小，形状，团聚水平和周围环境。首先，金纳米颗粒与入射光发生表面等离子体共振作用时，粒子特定部位发生强烈的电荷集聚和振荡效应，在其近场区域产生强烈的电磁场。这种表面等离子体共振效应(SPR)能增强其表面的电磁场，影响靠近它们的荧光基团的荧光发光效应。同时，金纳米粒子拥有很大的X射线吸收系数，是用来做CT造影剂的理想选择。金纳米粒子的这些特性是其在生物传感和成像应用的基础。
[0005]通过表面包覆一层均匀的壳，可以进一步拓宽金纳米粒子在生物方面的应用。最常用的包覆材料是二氧化硅。二氧化硅包覆的金纳米粒子是一种能够高度功能化的可定制材料，比起壳核单一成分，它表现出更强的更独特的性质。比如，包覆后的金纳米粒子的单分散性更好，粒径分布更均匀，对外界环境有更强的化学稳定性，更强的发光特性，并且包裹二氧化硅能引进功能基团，使纳米金生物标记成为可能，将金纳米粒子的应用扩展到生物靶向性传感和药物的靶向传输。
[0006]由于在紫外可见范围的荧光成像受到组织自发荧光干扰，并且紫外-可见光对组织的穿透深度只有几百微米，导致传统荧光成像信噪比低，成像效果差。在近红外区域，组织自发荧光最弱，更容易获得更清晰的荧光图像。常见的近红外荧光探针有小分子荧光染料和半导体量子点，这些材料的缺点是价格成本高，且对生物体有毒性。所以开发一种经济无毒的近红外荧光生物探针至关重要。荧光卟啉的发射波长位于近红外区域，但是其激发波长很短，有细胞毒性且水溶性差。但是卟啉的堆叠效应能使吸收光谱红移。将卟啉嵌入二氧化硅网格能够使卟啉稳定保持J聚集状态，这种方法也可以降低卟啉的毒性，增强水溶性。
[0007]目前大部分关于金纳米粒子的专利都只涉及了金纳米粒子或者金纳米簇的制备，以及单独二氧化硅包覆纳米颗粒的制备。如，发明专利“X射线或者CT造影剂用金纳米粒子的制造方法”(W02011097824A1)公开了一种利用物理方式的新概念纳米粒子制造装置的金纳米粒子制造方法及利用此制造方法的金纳米粒子造影剂的制造方法；中国发明专利“水溶性金纳米团簇的制备方法”(CN101406961A)公开了一种粒径为1.5±0.2nm具有高分散性的水溶性金纳米团簇的制备方法；中国发明专利“二氧化硅包裹氧化铁的方法”(CN100545218C)公开了一种二氧化硅包裹氧化铁的方法；中国发明专利“一种制备表面包裹有二氧化硅层的金纳米棒颗粒的方法”(CN101230208A)公开了一种制备表面包裹有二氧化硅层的金纳米棒颗粒的方法。而本发明制备的叶酸标记的荧光二氧化硅包裹金纳米粒子的工艺还未见相关报道，尤其是用一种卟啉物做荧光基团的壳核型纳米探针的方法未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种叶酸标记的荧光二氧化硅包覆金纳米粒子的壳核型纳米颗粒(FA-AuNPs@Si02-TCPP)的制备方法，该方法制备出的金纳米制剂具有单分散，稳定性好，细胞毒性小的优点。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种高分辨率CT成像的CT造影剂的制备方法。
[0010]本发明的进一步目的是提供一种近红外荧光成像探针的制备方法。
[0011]本发明的进一步目的是提供一种能够靶向肿瘤细胞的荧光探针的制备方法。
[0012]为达到以上的目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的。
[0013]步骤I,金纳米粒子(AuNPs)的制备步骤:
[0014]步骤1.1，称取0.1mg柠檬酸钠，溶解在1ml去离子水中，得到1%的柠檬酸钠溶液；
[0015]步骤1.2，取I %氯金酸溶液lmL，加入99mL去离子水，得到0.01%氯金酸溶液；
[0016]步骤1.3，将0.01 %氯金酸溶液煮沸，冷凝回流持续搅拌15分钟，一次性快速I %柠檬酸钠溶液3mL，继续反应30分钟，得到的是粒径约为18nm的AuNPs (CAu =
0.0038g.L ”。
[0017]步骤2，TCPP前驱体的制备步骤:
[0018]步骤2.1，TCPP溶解在有机溶剂中，浓度为3.75mM，然后加入EDC (15_30禮)，静置20分钟后，加入NHS (15-30mM)，活化TCPP的羧基；所述有机溶剂为N，N- 二甲基甲酰胺，反应温度为室温；，
[0019]步骤2.2，将APTES(15-30mM)加入上述活化羧基后的TCPP混合液中，室温条件下避光搅拌24h ；
[0020]步骤2.3，将反应后的产物放入_80°C冰箱过夜，然后在真空冷冻干燥机中冻干12-24h，除去有机溶剂，得到粉末状的TCPP前驱体。
[0021]步骤3, 二氧化娃包覆金纳米粒子(AuNPs@Si02)的制备步骤:
[0022]步骤3.1,配制1.68-16.8g.L 1的PVP水溶液，超声振荡15分钟；
[0023]步骤3.2，将PVPlO溶液(0.65mL)与步骤I制得的金纳米粒子溶液(34.7mL)混合，室温下避光搅拌24h ;离心上述反应物，收集沉淀物；
[0024]步骤3.3，将离心后的沉淀重悬在乙醇氨水溶液(4.2vol.%氨水溶在乙醇中)中，使得金浓度为0.59g.L 1 ;
[0025]步骤3.4，迅速将体积为100-500 μ L的10vol.% TEOS乙醇溶液倒入上述混合液中，室温下剧烈搅拌12h;
[0026]步骤3.5，产物用8000rpm转速离心10分钟，用无水乙醇洗去杂质，重复三次，得到二氧化娃包覆金纳米粒子(AuNPs@Si02)。
[0027]步骤4，荧光二氧化硅层包覆金纳米粒子(AuNPs@Si02-TCPP)的制备步骤:
[0028]步骤4.1,将步骤3所得离心后的AuNPs@Si02重悬在氨水乙醇溶液(5mL无水乙醇，200 μ L氨水)；
[0029]步骤4.2，向混合物中加入步骤2所得的TCPP前驱体，摩尔比为1:1，室温下剧烈搅拌；
[0030]步骤4.3，加入TEOS (0.5_2mM)和APTES (0.5_2mM)，室温下避光剧烈搅拌24h ；
[0031]步骤4.4，将产物用5000-10000rpm转速离心10分钟，用无水乙醇反复洗涤3次，最后重悬在去离子水中，即得到荧光二氧化硅层包覆金纳米粒子(AuNPs@Si02-TCPP)。
[0032]步骤5，叶酸标记的荧光二氧化硅层包覆的金纳米粒子(FA-AuNPs@Si02-TCPP)的制备过程:
[0033]步骤5.1，将叶酸溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为1.0-3.0mM，超声振荡使其完全分散；
[0034]步骤5.2，将EDC加入叶酸DMSO溶液中(摩尔比为1:1)，静置20min后，加入NHS (摩尔比为1:1)，室温条件下搅拌Ih ；
[0035]步骤5.3，将步骤4所制得的荧光二氧化硅层包覆金纳米粒子(AuNPs@Si02-TCPP)加入活化后的叶酸溶液中，室温搅拌3h ；
[0036]步骤5.4，离心收集反应产物，用PBS缓冲液洗涤三次，重悬在PBS缓冲液并放入4摄氏度冰箱保存，即得到叶酸标记的荧光二氧化硅层包覆的金纳米粒子(FA-AuNPsOS12-TCPP)。
[0037]需要注意的是，上述方案中，步骤2.1所述的EDC和NHS的浓度为15_30mM，浓度比为1:1 ;步骤2.2中所述的APTES浓度为15-30mM ;步骤3.1中所述的PVPlO的质量浓度为
1.68-16.8g-L 1 ;步骤3.4中所述的TEOS乙醇溶液体积为100-500 μ L ;步骤4.3中所述的TEOS和APTES浓度为0.5-2mM ;步骤4.4产物用5000-10000rpm ;步骤5.1中所述的叶酸浓度为1.0-3.0mM ;步骤5中AuNPs@Si02_TCPP表面的叶酸靶向肿瘤细胞的叶酸受体，对肿瘤细胞进行特异性结合。
[0038]本发明与现有技术相比较所具有的有益效果:
[0039]本发明所涉及到的合成方法简便易操作，纳米粒子具有形态均一，粒径分布范围窄，单分散性好且粒径小且可控的优点。
[0040]本发明所合成的纳米探针具有稳定的近红外荧光特性。
[0041]本发明所合成的纳米探针良好的CT造影特性。