一种鹿骨胶原肽和活性钙复剂的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种利用联合酶解级微生物发酵的方法从鹿 骨中提取胶原多肽及活性钙复合物的方法。
【背景技术】
[0002] 鹿骨是鹿的骨骼，含有大量胶原蛋白、磷脂质、磷蛋白、维生素，还含有多种矿物质 元素如钙、镁、铁、锌、钾、铜等，具有重要的生理功能和多种药理活性。有文献记载，鹿骨胶 具有补肾壮阳、益气补血、祛风除湿功能，对久病体弱、精髓不足、贫血、风湿、四肢疼痛等症 有较好的临床疗效。
[0003] 胶原（collagen)是一种由动物细胞合成的生物高分子，是动物结缔组织中的主 要成分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，在动物体内起支持、保护、连接等多种作 用。胶原与人体的生长、衰老以及健康、疾病有着密切的关系，因此可广泛应用于食品、保健 品、药品、化品等领域。
[0004] 从目前的研究状况来看，制备胶原多肽的原料主要有畜禽的皮和鱼类的皮、骨、 鳞等，采用鹿骨制备胶原多肽的研究很少，作为养鹿业较为发达的国家，我国对鹿骨这样 的产业副产物的研究利用较少，如何科学有效开展鹿骨综合利用就成为了一个重要的问 题，采用一定的科学方法将鹿骨制备成胶原多肽成为一条很好的鹿骨利用途径；与此同时， 提取胶原多肽后的鹿骨残渣中含有丰富的钙质，采用相应技术手段将其转化提取，制备成 易于人体吸收的钙质，将大大提高鹿骨的综合利用水平。
[0005] 目前，现有的加工技术多是对鹿骨进行单一酶解或联合酶解得到得到鹿骨多肽， 极少数采用单一酶解后再对鹿骨进行超微粉碎得到鹿骨肽钙复合物，上述方法对鹿骨的综 合利用率低，且得到的样品生物活性不高。本发明首先应用的是联合酶解的方法，提高了 酶解的效率，增加了鹿骨多肽的收率，同时酶解后的残渣再通过乳酸菌发酵游离并富集鹿 骨中的钙质，使鹿骨中的无机钙转化成高活性有机钙，该专利方法得到的鹿骨胶原肽钙复 合物的预防骨质疏松效果明显强于其他方法得到的鹿骨胶原肽及鹿骨胶原肽钙复合物，具 有，工艺过程简单，生产成本低，适合于产业化生产等优点。
【发明内容】
【发明内容】
[0006] ：本发明是一种利用复合酶酶解与乳酸菌发酵联用技术从鹿骨中提取鹿 骨多肽和活性钙复合物的。该方法提取效率高，生产成本低，工艺流程简单，无环境污染，适 合于工业生产，得到的产品具有显著的预防预防骨质疏松效果。
[0007] 本发明的技术方案如下：T鹿骨前处理：取梅花鹿骨或马鹿骨，除去骨髓， 50-80Γ烘干，粉碎过60-100目筛，备用鹿骨胶原多肽的提取：取步骤公中的鹿骨 粉，加入8-10倍量0· 1-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液，加入1%-5%胃蛋白酶，在PH2-5的条件下 37-45°C酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入1%-5%木瓜蛋白 酶，在PH6-8的条件下45-60°C继续酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，将两次酶解上 清液合并，通过纳米滤膜（500-1000KD)，收集被截留的多肽，冷冻干燥，即为鹿骨多肽；:_ 活性钙的提取：取酶解后的残渣，接入3%-6%乳酸菌、3-10%碳源及5%-20%天然西红柿培 养基发酵20-40小时，加入8-12倍量蒸馏水，组织破碎，4000-6000转/分钟离心，取上清， 减压浓缩干燥，即得活性钙；?将步骤③中得到的鹿骨多肽与步骤議中得到的活性钙混合 均匀，即为鹿骨胶原、肽活性钙钙复合物。与现有方法比较，有以下优点：:戀本发明采用的 是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解，提高了酶解效率；本发明采用的是纳米滤膜富集后 冷冻干燥的方法，避免了加热过程，保持了蛋白和多肽的活性；議本发明将酶解后的残渣 进行二次利用，利用乳酸菌发酵富集钙质及有益离子，将鹿骨中的无机钙转化为高活性的 有机钙，易于人体吸收；④本发明得到的鹿骨肽钙复合物在预防骨质疏松方面的活性远高 于其他方法得到的鹿骨肽及鹿骨肽钙复合物的活性。
[0008] 具体实施例：实施例1: :1>鹿骨前处理：取梅花鹿骨，除去骨髓，60 °C烘干，粉碎过 60目筛，取1.0 kg备用；：鹿骨胶原多肽的提取：取步骤議中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的 磷酸盐缓冲液10L，加入胃蛋白酶20g，在PH 3. 0的条件下40°C酶解5小时，5000转/分 钟离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶30g，在PH7. 0的条件下50°C继续酶解5小时， 5000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD)，收集，被截留的大分子 多肽，冷冻干燥，得鹿骨多肽190g ;'f:活性钙的提取：取酶解后的残渣，加入碳源(葡萄糖： 蔗糖=3:7) 50g，超微粉碎西红柿泥150g，灭菌后，接种乳酸乳杆菌与干酪乳杆菌干酪亚种 (1:1)双菌株发酵，接种量为4%，在37°C振荡培养24h后，45°C下再静止发酵18h，加入IOL 蒸馏水，组织破碎，5000转/分钟离心，取上清，60cC减压浓缩干燥，即得活性钙370g 将步骤議中得到的鹿骨多肽与步骤議中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物553g。
[0009] 实施例2:,鹿骨前处理：取梅花鹿骨，除去骨髓，50Γ烘干，粉碎过80目筛，取 2. Okg备用；:議鹿骨胶原多肽的提取：取步骤③中的鹿骨粉，加入0. lmol/L的磷酸盐缓冲 液12L，加入胃蛋白酶30g，在PH 4. 0的条件下37°C酶解6小时，6000转/分钟离心，上清 液备用，残渣加入木瓜蛋白酶35g，在PH8. 0的条件下55°C继续酶解6小时，6000转/分 钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD)，收集被截留的大分子多肽，冷冻干 燥，得鹿骨多肽370g ;議:活性钙的提取：取酶解后的残渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 120g，超微粉碎西红柿泥310g，灭菌后，接种嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌（1:1)双菌株发酵， 接种量为5%，在37°C振荡培养20h后，42°C下再静止发酵20h，加入20L蒸馏水，组织破碎， 6000转/分钟离心，取上清，55°C减压浓缩干燥，即得活性钙730g ;:左将步骤中得到的鹿 骨多肽与步骤1中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物l〇83g。
[0010] 实施例3: _鹿骨前处理：取马鹿骨，除去骨髓，65Γ烘干，粉碎过100目筛，取 5. Okg备用；_鹿骨胶原多肽的提取：取步骤①中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的磷酸盐缓冲 液50L，加入胃蛋白酶140g，在PH 5. 0的条件下40°C酶解8小时，5000转/分钟离心，上清 液备用，残渣加入木瓜蛋白酶190g，在PH6. 5的条件下50°C继续酶解8小时，5000转/分 钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD)，收集被截留的大分子多肽，冷冻干 燥，得鹿骨多肽940g;：S活性钙的提取：取酶解后的残渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 60g，超微粉碎西红柿泥160g，灭菌后，接种嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌（1:1)双菌株发酵，接 种量为5%，在37°C振荡培养20h后，42°C下再静止发酵20h，加入12L蒸馏水，组织破碎， 6000转/分钟离心，取上清，55°C减压浓缩干燥，即得活性钙1820g沒)将步骤?中得到的 鹿骨多肽与步骤議:中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物2695g。
[0011] 实施例4:、I.鹿骨前处理：取马鹿骨，除去骨髓，70°C烘干，粉碎过80目筛，取 IOkg备用；^鹿骨胶原多肽的提取：取步骤_中的鹿骨粉，加入0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液 100L，加入胃蛋白酶200g，在PH 3. 5的条件下38°C酶解6小时，5000转/分钟离心，上清液 备用，残渣加入木瓜蛋白酶300g，在PH7. 5的条件下53°C继续酶解6小时，5000转/分钟 离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD)，收集，被截留的大分子多肽，冷冻干 燥，得鹿骨多肽1650g 活性钙的提取：取酶解后的残渣，加入碳源(葡萄糖：蔗糖=3:7) 50g，超微粉碎西红柿泥150g，灭菌后，接种保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌（1:1)双菌株发 酵，接种量为6%，在37°C振荡培养25h后，45°C下再静止发酵20h，加入100L蒸馏水，组 织破碎，7000转/分钟离心，取上清，70°C减压浓缩干燥，即得活性钙3500g ;:1.将步骤⑩.中 得到的鹿骨多肽与步骤藝中