一种欧洲越橘提取物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物提取物，具体是一种欧洲越橘提取物及制备这种提取物的方 法。
【背景技术】
[0002] BV :树脂柱体积
[0003] DVB :二乙烯苯
[0004] 总花色苷：是15种花色苷的混合物，它们分别是：
[0005] 1.氯化飞燕草素-3-0-半乳糖苷，英文名称delphinidin-3-O-galactoside chloride
[0006] 2.氯化飞燕草素-3-0-葡萄糖苷，英文名称delphinidin-3-〇-glucoside chloride
[0007] 3.氯化矢车菊素-3_〇-半乳糖苷，英文名称cyanidin_3-〇-galactodise chloride
[0008] 4.氯化飞燕草素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名称delphinidin_3-〇-arabinoside chloride
[0009] 5.氯化矢车菊素-3-0-葡萄糖苷，英文名称 cyanidin_3-〇-glucoside chloride
[0010] 6.氯化矮牵牛素-3-0-半乳糖苷，英文名称petunidin-3-〇-galactoside chloride
[0011] 7.氯化矢车菊素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名称cyanidin-3-〇-arabinoside chloride
[0012] 8.氯化矮牵牛素-3_〇-葡萄糖苷，英文名称 petunidin_3-〇-glucoside chloride
[0013] 9.氯化巧药素-3_〇-半乳糖苷，英文名称 peonidin_3-〇-galactoside chloride
[0014] 10.氯化矮牵牛素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名称petunidin_3-〇-arabinoside chloride
[0015] 11.氯化巧药素-3-0-葡萄糖苷，英文名称 peonidin_3-〇-glucoside chloride
[0016] 12.氛化锦奏素-3_〇-半乳糖音，英文名称 malvidin_3-〇-galacoside chloride
[0017] 13.氯化巧药素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名称peonidin_3-〇-arabinoside chloride
[0018] 14.氯化锦葵素-3-0-葡萄糖苷，英文名称 malvidin_3-〇-glucoside chloride
[0019] 15.氯化锦葵素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名称 malvidin-3-〇_arabinoside Jiloride
[0020] AB-8和D101天津南开和成科技有限公司，
[0021] XAD-7HP陶氏化学公司，
[0022] HPD100沧州宝恩吸附材料科技有限公司
[0023] 上柱液：以欧洲越橘果或市售总花色苷含量36%欧洲越橘提取物为原料，制备含 总花色苷浓度为1. 5-5. 5mg/ml的酸性水溶液，该酸性水溶液在此定义为上柱液。
[0024] 欧洲越橘提取物（Bilberry Extract)是以成熟的欧洲越橘（Vaccinium myrtillus)浆果为原料，经提取、纯化得到的植物提取物，已载入欧洲药典（EP)植物药及 制法专论部分（Monographs on Herbal Drugs and Herbal drug preparations)，并作为膳食 补充剂（Dietary Supplments)载入美国药典（USP)。因其所含的花色苷类成分具有抗氧化、 清除自由基等生理活性，欧洲越橘提取物主要应用于功能性食品及医药工业中。EP及USP 中均对欧洲越橘提取物中总花色苷含量做出了规定。EP中规定，以高效液相色谱法（HPLC) 检测，以氯代矢车菊素-3-0-葡萄糖苷计，总花色苷含量在32. 4 %至39. 6 %范围内。USP规 定总花色苷含量不低于36%。
[0025] 花色苷分子由苷元（即花色素）及糖配基两部分组成。花色素是具有黄酮类化合 物C6-C3_C6结构的，2-苯基苯并吡喃的多羟基和甲基衍生物，以0-糖苷键与糖配基连接。 由于黄烊盐阳离子缺乏电子，游离的花色素很不稳定。在欧洲越橘提取物制备过程中，应尽 力避免糖配基的丢失，从而影响其稳定性。EP及USP均规定以氯代矢车菊素计总花色素含 量低于1% (HPLC)。
[0026] 现有文献报道中，存在于欧洲越橘中的花色苷苷元主要有五种，与3种糖配基形 成15种花色苷。不同花色苷生理活性上存在差异。各花色苷的比例是欧洲越橘提取物生 理活性的影响因素之一。EP中给出了这15种花色苷的HPLC指纹图谱，并作出了相关规定。
[0027] 目前，市售欧洲越橘提取物规格多为总花色苷含量36% (HPLC)，即符合USP规定， 未见指纹图谱符合欧洲药典规定，且总花色苷含量更高的产品报道。现有工业化制备欧洲 越橘提取物工艺的基本流程是：以酸化醇水溶液自欧洲越橘果中提取总花色苷，经回收溶 剂、浓缩的提取液通入大孔吸附树脂进行吸附。吸附结束后，水洗，以适当解吸剂对吸附于 树脂上的花色苷进行洗脱。洗脱液回收溶剂，浓缩，干燥，得到产品。其中大孔吸附树脂纯 化步骤决定产品中总花色苷含量。
[0028] 目前找到的和本发明的制备方法最为接近的现有技术为CN102240316B，其中针对 花色苷的热敏性，使用纳滤膜浓缩方法避免了回收溶剂、浓缩过程中加热造成的花色苷分 解。所制备的越橘提取物中花色苷含量未高于40%。该方法采用纳膜浓缩最大的缺陷就是 纳膜非常容易堵塞，需要频繁的清洗更换纳膜，不适于大规模的工业化生产。
[0029] 另一篇对比文献CN103467545A公开了一种从欧洲越橘中提取花色苷的方法。 欧洲越橘以酸性乙醇水溶液提取，提取液浓缩后，通入D101大孔吸附树脂柱，水洗，以 40-60%乙醇水溶液洗脱花色苷。洗脱液浓缩、干燥后所得粗提物。截止到粗提物这一步基 本与CN102240316B的技术方案相似，得到粗提物后又以丙酮进行亚临界萃取。这篇对比文 件中尽管总花色苷含量约为70%，但是所得成品收率仅为0. 5%，并且亚临界萃取需在密 闭、无氧、低压的压力容器内进行，对设备要求高，生产成本高，工艺复杂。此外，此发明并未 明确描述总花色苷检测方法、含量测定基准物、以及指纹图谱，无法获知其产品质量监控的 所有条件。
[0030] 近年来由于花色苷具有增强免疫系统功能，预防心血管疾病，预防癌症，抑制肿瘤 细胞生长，预防关节炎、肿胀等炎症，缓解过敏症，增强动脉、静脉及毛细血管弹性等众多生 理功能而备受关注。但是却缺少为诸多研究提供1?浓度的花色昔的物质基础，得到1?浓度 总花色苷的方法尚且如此困难，从中分离高浓度的单体更是难上加难，因此亟需一种高浓 度的总花色苷作为药理、临床、以及进一步分离提纯单体作为研究的物质基础；当然要想得 到这样高浓度花色苷首先需要建立一种简单、高效的花色苷提取物制备方法、检测方法作 为技术支持。当然这些研究开发对欧洲越橘提取物进一步的成分开发、利用也具有十分重 要社会价值和经济价值。
【发明内容】
[0031] 本申请发明人通过创造性的劳动发现，在用大孔吸附树脂提取欧洲越橘物的现有 方法中，大孔吸附树脂内部结构是制备高纯度花色苷方法中关键中的关键步骤，换句话说， 只要选对大孔吸附树脂的结构，并控制好大孔吸附树脂的投料比就攻克了该方法的最核心 部分；其次关键步骤还包括解析剂所用酸醇的比例。该方法不仅不需要像CN103467545A那 样对上柱液先浓缩，更不需要对得到的提取物进行像CN102240316B那样的浓缩处理，就能 够达到总花色苷的含量高达95%，且收率为大于60%。本发明另一个显著地有益效果体现 在没有放大效应，适于大工业生产，是目前工艺步骤最为简便、成本最为低廉的方法。更具 体的本发明体现在以下两个方面：
[0032] 首先，本发明提供了一种总花色苷含量55% -95%的欧洲越橘提取物，并提供了 该提取物的鉴定以及监控方法：欧洲越橘提取物为紫黑色，具有越橘特殊气味的均匀无定 形粉末。以欧洲药典规定的高效液相色谱方法检测，以干物计，总花色苷含量在55%至 95%范围内，总花色素含量不高于1%。HPLC指纹图谱符合欧洲药典要求。
[0033] 其次，本发明提供了一种制备总花色苷含量在55% -95%的欧洲越橘提取物的方 法，的目的通过下述的技术方案实现：
[0034] 制备方法是以欧洲越橘果或市售总花色苷含量36%欧洲越橘提取物为原料，制备 含有越橘总花色苷的酸性水溶液，以大孔吸附树脂吸附其中花色苷，酸水洗后，酸性乙醇水 溶液解吸花色苷，解吸液浓缩、喷雾干燥，即得产品。制备过程中总花色苷保留率，即收率 闻于80 %。
[0035] 本发明提供的欧洲越橘提取物制备方法包括的步骤：
[0036] 1)以欧洲越橘果或市售总花色苷含量36%欧洲越橘提取物为原料，制备含总花 色苷浓度为1. 5-5. 5mg/ml的酸性水溶液，该酸性水溶液又称为上柱液。
[0037] 2)上柱液通入经预处理的大孔吸附树脂柱，进行吸附。吸附结束后，以酸性水洗至 流出液澄清，再以乙醇、或者甲醇或者丙酮酸性水溶液为解吸剂，进行解吸，分部接受洗脱 液合并其中总花色苷含量为55% -95%的部分，浓缩，喷雾干燥，即得成品。
[0038] 上述技术方案中：
[0039] 步骤1)中如以欧洲越橘果为原料，以如下步骤制备酸性水溶液：
[0040] 以组织匀浆机将欧洲越橘果破碎为果浆。以2-5倍果浆质量的、体积分数为 30-80%的、并以盐酸调pH值2-3的乙醇水溶液，于40-60°C加热回流提取2-3次，过滤，滤 液合并，回收乙醇，浓缩。优选的提取溶剂体积分数为60%，并以盐酸调pH值为2的乙醇水 溶液，用量为果浆质量的3倍，于50°C加热回流提取2次。
[0041] 步骤1)中如以市售总花色苷含量36%的欧洲越橘提取物为原料，称取提取物，加 水搅拌溶解，配制提取物浓度为5-15mg/ml的溶液，并以盐酸调pH值至酸性，优选pH在2-5 范围内。
[0042] 步骤2)中所用大孔吸附树脂为以聚苯乙烯为主要骨架自制大孔吸附树脂。
[0043] 自制大孔吸附树脂可由以下步骤制备：
[0044] a)将聚乙烯醇和氯化钠配制为水溶液，作为悬浮聚合水相；
[0045] b)将质量纯度为55-80 %的二乙烯苯（DVB)与酯类单体依投料比混合，加入致孔 剂、引发剂，混合均匀后，为悬浮聚合油相；
[0046] c)将a)制得水相加热至30_50°C，将b)制得的油相加入上述水相中，在搅拌下 65-75°C下反应4-6小时，升温至80-85°C继续反应2-3小时，经过滤，依次以热水、乙醇洗 涤，干燥，即得成品。
[0047] 在自制大孔吸附树脂的技术方案中：
[0048] 步骡a)中水相中聚乙烯醇质量浓度为0. 5-1. 5%，氯化钠水溶液质量浓度为5%。
[0049] 步骤b)中酯类单体为二甲基丙烯酸乙二醇酯，或者丙烯酸甲酯，或者甲基丙烯酸 甲酯中的一种或几种；
[0050] DVB与酯类单体投料比为19 : 1-7 : 3,优选的为9-4 : 1 ;
[0051] 致孔剂为甲苯、或200#汽油、或环己烷、或甲基环己烷中的一种或几种，优选的为 甲苯、200#汽油混合物，两者质量比为4-1 : 1;致孔剂加入量为DVB与酯类单体质量总和 的 100-200% ;
[0052] 引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰，加入量为DVB及酯类单体质量和的 1-2%。
[0053] 步骤c)中水相与油相的体积比为2. 5-4 : 1。
[0054] 步骤2)中大孔吸附树脂柱柱径比为3-10 : 1。
[0055] 步骤