一种小鼠结核自然潜伏感染模型制备和药物评价方法的建立的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物模型构建和药物评价技术领域，尤其涉及一种小鼠结核自然潜伏 感染模型制备和药物评价方法的建立。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染 最为常见。结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，目前全球有约20亿人被感染， 每年新出现结核病患者约800-1000万，每年因结核病死亡人数约为200-300万。目前我国 结核病年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数 的总和。
[0003] 结核的潜伏感染模型是进行药物和疫苗评价、潜伏感染机制研究的重要工具，有 小鼠、豚鼠、兔子、大鼠和猴的潜伏感染模型，其中小鼠模型应用最为广泛。
[0004] 现有的小鼠潜伏感染模型制备技术有两种：其一为利用低剂量结核菌自然潜伏感 染获得；其二为中剂量结核菌感染后用干预因子如抗生素和BCG等免疫制剂作用，获得结 核的潜伏感染模型。低剂量自然感染模型虽然感染过程与人的潜伏感染类似，但已有的模 型肺、脾荷菌量较高（4~51oglOCFU)，潜伏期较长（可长达107周），研究潜伏复发的机制， 以及利用复发情况来进行药物疫苗的评价研究周期过长，不利于研究的开展。而干预因子 作用后获得的潜伏感染模型跟人的自然潜伏感染过程不同，早期的免疫机制无法研究，潜 伏期较长且长短不一，复发情况差异大，很难标准化评价研究药物和疫苗。
[0005] 因此，进一步研究实用性较好的小鼠结核潜伏感染模型建立方法十分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种小鼠结核潜伏感染模型的建立 方法，以本发明提供方法构建的模型潜伏期稳定，能够缩短药物评价的周期。并且，以本发 明提供方法构建的模型核菌量较低、复发情况差异不大，更加符合人的自然潜伏感染过程。
[0007] 本发明提供的小鼠结核潜伏感染模型的建立方法，以结核菌感染小鼠，感染剂量 为100CFU/小鼠。
[0008] 本发明采用适宜的感染剂量来建立小鼠结核潜伏感染模型，在该感染剂量下，小 鼠的潜伏期较短，符合人的自然潜伏感染特征，方便研究的进行，尤其是潜伏的急性反应期 能进行快速药物评价。即给予每只小鼠感染剂量为80CFU~100CFU结核菌的条件下，能够 起到缩短潜伏期，获得稳定的急性反应期作用。
[0009] 在本发明的实施例中，构建结核潜伏感染模型采用的小鼠为C57小鼠。
[0010] 在一些实施例中，采用的C57小鼠为雌性小鼠。
[0011] 在本发明的实施例中，结核菌为结核杆菌标准菌株H37Rv。
[0012] 在本发明的实施例中，感染采用结核菌悬液，悬液的溶剂为生理盐水。
[0013] 在本发明的实施例中，结核菌悬液中，结核菌的浓度为lX103CFU/mL。
[0014] 本发明中，结核菌悬液的制备方法为：对数期的结核菌以生理盐水悬浮后，以直径 5 μ m的过滤器过滤，获得结核菌悬液。
[0015] 在本发明的实施例中，感染的部位为尾静脉。
[0016] 在本发明的实施例中，感染的方式为尾静脉注射。
[0017] 在本发明的实施例中，注射的结核菌悬液的量为0. 1ml/小鼠。
[0018] 在本发明的实施例中，感染正常饲养，自由进水食，所述正常饲养的温度为 23°C ±2°C，湿度为50% ±10%，光照12h/12h明/暗循环。
[0019] 以本发明提供方法构建的小鼠结核潜伏感染模型有8周的急性反应期，整个潜伏 期较短，能够控制在20周以内，而现有技术构建模型的潜伏期最长可达107周。可见，本发 明提供的方法构建模型更能够模拟自然潜伏感染，显著缩短潜伏期。并且，以本发明提供方 法构建的模型在潜伏早期有急性反应期，潜伏中后期仅表现为轻微的炎性反应，肺脏的荷 菌量不高于1. 51og1(]CFU，脾脏的荷菌量不高于41og1(]CFU，肺部、脾脏和肝脏的组织病变较 轻，无明显的组织病理病变；这些特征符合人的自然潜伏感染的特点。说明，本发明提供的 方法能够再现早期的反应，缩短潜伏期，方便潜伏和复发机制的研究。并且未使用任何干预 因子，与人的自然潜伏感染过程相同，便于研究早期的免疫机制。另外，本发明提供方法构 建的模型，其潜伏的急性期稳定，能够快速评价研究药物和疫苗。
[0020] 本发明提供的建立方法建立的小鼠结核潜伏感染模型。
[0021] 以本发明提供方法建立的小鼠结核潜伏感染模型感染后8周为急性反应期；感染 8周~20周为稳定的潜伏期；感染后20周为复发期。
[0022] 本发明中，结核菌感染小鼠后直至20周为小鼠的潜伏期。其中，从感染至第8周 为小鼠的急性反应期，在这一时间段内，小鼠肺、脾组织的荷菌量先是急剧升高而后又降至 极低水平，在3周出现小高峰，小鼠的肺、脾、肝在5周出现结核特征性病变小高峰，后减轻 至轻微的炎性反应。模型的急性反应期可用于筛选治疗或预防结核病的药物或疫苗，也可 用于结核病急性反应期的发病机制和免疫机制的研究。由于这一阶段时间较短，且具有典 型的急性期的结核反应，故而用于药物或疫苗的快速评价和筛选更加的准确可靠。相对而 言，本发明的模型急性期首次用于药物的快速评价，现有技术制备的模型一般用潜伏晚期 的复发来评价药物，耗时过长；而其急性期的结核反应过重，未用于也不利于药物的评价和 筛选。
[0023] 本发明还提供了预防结核的药物或疫苗的筛选方法，具体为：小鼠给予待筛选的 药物或疫苗后，以本发明提供的方法建立小鼠结核潜伏感染模型。
[0024] 在一些实施例中，小鼠给予待筛选药物或疫苗4周后，以本发明提供的方法建立 小鼠结核潜伏感染模型，继续给予待筛选药物直至感染后第16周。
[0025] 作为优选，于8周急性反应期内筛选预防结核的药物或疫苗。
[0026] 本发明还提供了治疗结核的药物或疫苗的筛选方法，具体为：以本发明提供的方 法建立小鼠结核潜伏感染模型后，给予待筛选的药物或疫苗。
[0027] 在一些实施例中，以本发明提供的方法建立小鼠结核潜伏感染模型后，当天给予 待筛选的药物或疫苗，直至感染后第16周。
[0028] 作为优选，于8周急性反应期内筛选治疗结核的药物或疫苗。
[0029] 本发明提供的筛选药物或疫苗的方法，采用本发明提供方法构建的小鼠结核潜伏 感染模型，其利用小鼠发明的急性期和稳定的潜伏期，在8周内即实现了药物的快速评价。 而在现有的方法所构建的模型中，急性期往往不利于药物的评价和筛选，药物的筛选需要 等待小鼠经过107周的潜伏期才能进行，周期过长。
【附图说明】
[0030] 图Ι-a~图1-〇示小鼠的肺、脾组织病理病变；其中，图Ι-a示感染0周后肺组织 的病理情况；图Ι-b示感染3周后肺组织的病理情况；图1-c示感染5周后肺组织的病理情 况；图Ι-d示感染8周后肺组织的病理情况；图Ι-e示感染20周后肺组织的病理情况；图 Ι-f示感染〇周后脾组织的病理情况；图Ι-g示感染3周后脾组织的病理情况；图Ι-h示感 染5周后脾组织的病理情况；图Ι-i示感染8周后脾组织的病理情况；图Ι-j示感染20周 后脾组织的病理情况；图Ι-k示感染0周后肝组织的病理情况；图1-1示感染3周后肝组织 的病理情况；图Ι-m示感染5周后肝组织的病理情况；图1-n示感染8周后肝组织的病理情 况；图1-〇示感染20周后肝组织的病理情况；
[0031] 图2-a~图2-1示各组小鼠的肺组织病理病变；其中，图2-a示模型对照组感染3 周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-b示模型对照组感染5周肺组织HE染色显示的组 织病变；图2-c示模型对照组感染8周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-d示模型对照 组感染16周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-e示预防组感染3周肺组织HE染色显示 的组织病变；图2-f示预防组感染5周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-g示预防组感 染8周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-h示预防组感染16周肺组织HE染色显示的组 织病变；图2-i示治疗组感染3周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-j示治疗组感染5 周肺组织HE染色显示的组织病变；图2-k示治疗组感染8周肺组织HE染色显示的组织病 变；图2-1示治疗组感染16周肺组织HE染色显示的组织病变。
【具体实施方式】
[0032] 本发明提供了一种较之以前更理想的小鼠结核自然潜伏感染模型的建立方法，并 基于该模型提出一种新的药物评价技术体系，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改 进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了 描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动 或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0033] 本发明采用的试剂、菌种、实验动物或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0034] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0035] 实施例1小鼠结核潜伏感染模型的构建
[0036] 从维通利华公司购买SPF级C57小鼠（6-8周龄，雌性，450只），进入ABSL-3适应 1周。所有小鼠均遵照动物福利伦理要求饲养，获得中国医学科学院医学实验动物研究所动 物福利伦理委员会的审批号ILAS-PC-2013-015。小鼠进入ABSL-3实验室后，每笼6只，自 由进水食，实验室湿度（50±10% )，光照（12/12h明/暗循环），温度（23±2°C )。实验终 点小鼠固定，实施安乐死。
[0037] 结核菌H37Rv在L-J培养基上生长3周至对数生长期，加入2ml 0. 9%NaCl，用无 菌L玻璃棒刮下结核菌落，用lml移液管反复吹吸混匀，将菌悬液过5- μ m -次性过滤器， 获得菌浓度为~1X l〇7CFU) /mL的单细胞悬液。将单细胞悬液分装，取1份接种于L-J斜 面，生长3~4周后计数菌落。