一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，具体涉及一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗及其制备方法，特别涉及一种通过原位矿化在疫苗表面引入非连续性的、无定形水合态二氧化硅来制备热稳定疫苗的方法。
【背景技术】
[0002]传染性疾病对人类生命安全造成严重的威胁，导致每年超过17, 000, 000人的死亡，占全球全部死亡人数的25%左右。疫苗接种是人类发展出来的对抗传染病最有效的医疗干预手段之一。减毒活疫苗(即病毒的减毒毒株)是最为重要的一种疫苗形式，在天花和脊髓灰质炎的消灭过程中发挥了巨大作用。由于疫苗具有温度敏感性，因此需要低温保存。但在缺乏足够的财力和电力来保障疫苗冷链的贫困地区，冷链是影响疫苗免疫计划成效的最主要因素。据统计，由于储藏或运输不当，每年约有50%的疫苗被浪费。冷链在免疫计划占有很大的费用比例，尤其在发展中国家，冷链花费甚至可占免疫总财政支出的80 %以上。即便在发达国家如美国大约有17-37%疫苗在运输和保存过程不能严格地处于冷链条件下。同时，低温冷冻还会导致疫苗免疫原性的降低。因此，发展热稳定性疫苗在科学研究和社会应用中都具有非常重要的意义，被《科学》杂志和比尔盖茨基金会列为全球人类健康的巨大挑战之一。
[0003]现有的改善苗稳定性的方法包括:(1)在疫苗的冻干技术中，采用糖玻璃化干燥、喷雾干燥等，以增强疫苗的稳定性；(2)在疫苗中添加重水、MgCl2、蛋白质或非还原性糖等稳定剂的方式来增加其稳定性；(3)随着分子生物学的进步，人们寻求通过增加蛋白亚单位之间、衣壳-核酸之间的静电吸引力或者引入二硫键的方式等来提高疫苗的热稳定性。然而，制备干粉疫苗需要复杂的操作步骤和昂贵的仪器，且冻干处理过程会影响疫苗的免疫原性；而在液态条件下，加入重水、增加亚基之间静电相互作用等方式对提高疫苗的热稳定性效果的十分有限。因此，发展一种简单、经济、有效的制备液态热稳定疫苗的新策略具有重要的科学意义和社会价值。
[0004]自然界中一些生物体能利用生物矿化来行使自我保护功能，例如软体动物中的碳酸钙外壳、硅藻的二氧化硅外壳和鸡蛋的碳酸钙外壳。受这些现象的启发，发明人在前期工作中利用仿生矿化成功在疫苗表面引入一层纳米磷酸钙外壳，可以在不影响疫苗本身生物学活性的基础上提高疫苗的耐热性，使得疫苗在室温下能保存7天(中国专利CN104096235 A)。但在生物矿化的研究过程中发明人注意到，矿物材料限制周围水分子的能力(即形成水玻璃的能力)，对其热保护内部疫苗具有重要的意义。而磷酸钙相的复杂性，及其无定形相的不稳定性限制了它作为保护性矿化材料的效果，难以实现疫苗液长时间的的常温保存。因此，需要采用更为有效的手段，在不妨害疫苗生物学活性的前提下，提高疫苗的热稳定性，目前尚未实现疫苗液在室温下保存一个月以上，并且能基本保持疫苗生物学活性的技术。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种表面具有无定形水合态二氧化娃材料(amorphous hydrated silica)的热稳定疫苗来实现疫苗液的常温保存，以及利用原位仿生娃矿化(in situ b1mimetic silicificat1n)在疫苗表面诱导形成无定形、水合态二氧化硅材料的方法。
[0006]本发明在疫苗表面引入纳米结构的无定形二氧化硅材料来提高疫苗的热稳定性。本发明通过实现二氧化硅在疫苗表面的特异性矿化，最终在不妨害疫苗本身生物学活性的前提下利用水合无定形态二氧化硅来提高疫苗的热稳定性。所述疫苗的生物学活性主要是指疫苗的免疫原性，若疫苗为病毒活疫苗还涉及其感染性滴度。所述的不妨害疫苗生物学活性是指二氧化硅矿物层的形成过程不会严重地降低疫苗本身的免疫原性(减毒活疫苗的感染性)。这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗可实现疫苗液在室温保存一个月以上仍保持其90%以上的活性，比磷酸钙矿化疫苗的热稳定性大幅度提高。这种基于原位仿生硅矿化提高疫苗稳定性的策略将为热稳定疫苗的发展提供一种新的思路。
[0007]本发明采用如下的技术方案:
[0008]—种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗，所述的疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层。
[0009]进一步地，所述的复合物为带正电荷的有机物与无定形水合态二氧化硅形成的有机-无机复合物。
[0010]进一步地，所述的有机-无机复合物为鱼精蛋白(protamine)-水合态二氧化娃复合物、R5肽(R5p印tide)-水合态二氧化硅复合物、聚乙烯亚胺(PEI)-水合态二氧化硅复合物；进一步地，所述R5肽的氨基酸序列为Ser-Ser-Lys-Lys-Ser-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ser-Lys-Arg-Arg-11e-Leu 〇
[0011]进一步地，所述无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层的厚度为10 ?200nm。
[0012]进一步地，所述疫苗与所述无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层的浓度比为 〇.l-5g/L(109-10nPFU/L): 120-1800mg/L ;优选为 lg/L(10nPFU/L): 180mg/L。
[0013]进一步地，本发明所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗，所述的单价疫苗是指由一种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品，所述的多价疫苗是指由一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
[0014]所述的基因工程活载体疫苗是指用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗；所述的多肽疫苗是指根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的疫苗；所述的基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗，是指通过DNA重组技术，在受体菌或细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因，制成的疫苗。该疫苗仅含有病原体的部分抗原，使其免疫反应为单一蛋白质所诱导。
[0015]进一步地，所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗。
[0016]进一步地，所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗中的任意一种或任意多种；所述的肝炎疫苗可以是甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗。
[0017]本发明所述的表面具有二氧化硅的热稳定疫苗具有优良的热稳定性，这种热稳定疫苗可以在室温条件下(25°C储存至少12天以上或在37°C高温环境中储存3天而不明显损失其免疫活性(维持90%以上的活性)，尤其是二氧化硅矿化的EV71和0PV疫苗可以在室温条件下(25°C储存35天以上或在37°C高温环境中储存14天后仍能保持90%以上的生物活性和良好的免疫原性。所述的生物活性是通过空斑定量检测病毒活疫苗的感染性颗粒滴度来确定的。
[0018]本发明还提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含上述表面具有二氧化硅的热稳定疫苗，以及提高所述疫苗稳定性或免疫原性的成分，例如，可以包含缓冲剂、稳定剂以及医学上可用的佐剂，尤其是A1 (0H)3佐剂(Alum)。
[0019]本发明所要解决的技术问题是在近生理条件下提供一种表面具有非连续存在的(noncontinous)、纳米结构的无定形水合态二氧化娃材料的热稳定疫苗(参见图2-6)。所述的无定形水合态二氧化硅材料可以是单纯的无定形水合态二氧化硅，也可以是无定形水合态二氧化硅的复合物。本发明所述的表面具有二氧化硅的热稳定疫苗是一种由内部的疫苗和外部一系列二氧化硅纳米簇构成的水合保护层。所述疫苗表面的二氧化硅材料层由许多纳米结构的二氧化硅团簇吸附在疫苗表面构成的是非均一、不连续的矿物层。所述的非均一是指纳米结构的二氧化硅簇吸附在疫苗表面形成矿物层厚度不均，粗糙不平；所述的不连续是指形成的二氧化硅团簇相对独立地附着在疫苗表面，二氧化硅团簇之间没有共价键连接。二氧化硅矿物层的这种非均一、不连续性，对维持疫苗的固有生物学活性非常重要。如果在疫苗表面引入完整的二氧化硅矿物层，这种完全包裹在疫苗表面的二氧化硅是通过共价键结合在一起的，很难被外部因素打开，因此，这种完整且连续的矿物层结构导致包覆在其内部的疫苗在细胞内和体内无法释放出来，进而严重损害疫苗的免疫原性(通过病毒活疫苗的感染性来说明，参见图22)。本发明所述的疫苗表面的无定形水合态二氧化硅层对疫苗固有的生物学活性，尤其是病毒活疫苗的抗原表达、生长趋势等生物学活性的影响很小，因此不妨碍疫苗的后续应用。所述疫苗本身的生物学活性主要是指疫苗的免疫原性，若疫苗为病毒活疫苗可以通过检测其感染性滴度来测定。所述的维持疫苗的固有生物学活性是指二氧化硅矿物层的形成过程不会严重地降低疫苗本身的免疫原性(减毒活疫苗的感染性)。
[0020]本发明通过在疫苗表面引入非连续存在的(noncontinous)、纳米结构(nano-structure)的无定形水合态二氧化娃材料，既维持了疫苗的生物学活性，又充分利用了二氧化硅矿物的热保护性能。疫苗表面非连续存在的二氧化硅纳米簇通过氢键相互作用与周围的水分子共同形成一种保护性的水合表层(Hydrat1n layer);这种水合表层在疫苗周围形成一种类水玻璃的保护层，缓冲和降低了分子热运动、盐键攻击等外部破坏因素向内部疫苗的传递，为内部疫苗提供了一个相对稳定的微环境。因此，本发明提供表面具有二氧化硅，同时具有良好免疫原性(图8和图12)和热稳定性(图9-10,图13-17,图19)的疫苗。由于本发明调控纳米结构的二氧化硅矿物在疫苗表面的特异性引入(可以是利用疫苗表面的碱性氨基酸或引入带正电荷的大分子作为成核基团)，即可实现疫苗的原位二氧化娃矿化(in situ silicificat1n)，大量的纳米结构的二氧化娃吸附在疫苗表面，形成一种非连续性的无定形水合态二氧化硅层，优选的无定形水合态二氧化硅层的厚度为10?200nm左右，进而为疫苗提供一种保护性的内部微环境。
[0021]现有利用二氧化硅提高蛋白质稳定性的策略主要利用溶胶-凝胶(sol-gel)法。该方法是将蛋白质限制(entraped)在二氧化硅凝胶中，形成一种蛋白-二氧化硅凝胶的复合物，进而禁锢了蛋白质的分子运动和键的交换。但是，该策略在疫苗的应用中有诸多限制:1)蛋白质-二氧化硅凝胶复合物在空间上限制了疫苗与细胞的接触，妨碍疫苗尤其是活疫苗的感染活性，进而损害疫苗的免疫原性；2)二氧化硅凝胶需要较高的二氧化硅浓度，不利于疫苗在注射中的应用，而且高浓度的二氧化硅回对机体造成一定的毒性。
[0022]本发明利用了疫苗颗粒表面的氨基残基或在疫苗表面引入外源带正电荷的大分子来诱导二氧化硅在疫苗表面的相对特异性沉积，降低了疫苗液中二氧化硅的浓度，更加有利于疫苗在注射以后良好地发挥其免疫原性，特别是减毒类活疫苗的感染特性。
[0023]本发明提供的表面具有二氧化硅水合表层的疫苗，可以在溶液状态下，在室温环境中(25°C)储存一个月以上仍保持90%以上的疫苗活性，与未处理疫苗在4°C冷冻环境中储存一个月后保持的疫苗活性相似。这种二氧化硅矿化疫苗甚至在超过37°C的高温环境中存储两周也能保持近90 %的疫苗活性。在本发明中，所述的疫苗活性主要通过利用空斑定量实验来检测减毒活疫苗中感染性病毒颗粒的滴度来计算，并在小鼠体内实验中进一步验证。
[0024]本发明提供的表面具有二氧化硅的热稳定性疫苗，与此前制备的磷酸钙矿化热稳定疫苗相比，具有显著改善的热稳定性。磷酸钙矿化的热稳定疫苗仅能将疫苗的热稳定性提高2-3倍左右，即实现疫苗液在室温环境(25°C )储存七天左右(参见对比实施例1，图21);而本发明引入的二氧化硅矿化能将疫苗的热稳定性提高7-10倍，可实现在室温环境(25°C )储存一个月以上仍保持90%以上的疫苗活性，与未处理疫苗在4°C冷冻环境中储存一个月后保持的疫苗活性相似。这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗在溶液条加下即可值得，储存备用，省去了疫苗冻干和重组等复杂的处理过程，很大程度上降低了疫苗对冷链的依赖，具有非常好的经济效益和社会效益。
[0025]本发明还提供了制备这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗的方法。
[0026]本发明提供一种在近生理条件下，在不妨害疫苗本身生物学活性的前提下，利用原位仿生娃矿化(in situ b1mimetic silicificat1n)制备所述热稳定疫苗的方法。
[0027]本方法的基本原理是利用了仿生硅矿化原理，利用了疫苗表面的氨基残基对二氧化硅矿化和絮凝的成核诱导作用，特异性地在疫苗表面引入了非连续锚定在疫苗表面的二氧化硅纳米簇，这些纳米簇与周围水分子一起构成了保护性水化层。
[0028]进一步地，还可以通过加入带正电的大分子作为诱导分子，并调节溶液pH值等条件，将疫苗表面本身或外源引入的富含正电荷的氨基残基作为二氧化硅的成核及絮凝位点，诱导新制备的硅酸在其表面相关位点的快速聚合、沉积和絮凝，进而在疫苗周围引入由纳米结构二氧化硅簇构成的保护性水化外层。
[0029]本发明提供的利用原位仿生娃矿化(in situ b1mimetic silicificat1n)方法制备表面具有二氧化硅的热稳定疫苗，包括如下步骤:
[0030]1)疫苗液加入新制备的硅酸或硅酸盐，调节溶液pH值至中性或弱酸性，即为初始体系；
[0031]2)将所述初始体系进行孵育；
[0032]3)孵育后，即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗，所述的热稳定疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅组成的水合表层。
[0033]其中，所述步骤1)调节溶液pH值的目的是降低疫苗表面负电性，使疫苗表面正电性氨基酸的氨基残基作为成核位点诱导二氧化硅纳米簇在疫苗的特异性形成，一系列矿化形成的纳米结构的二氧化硅团簇附着在疫苗表面，最终构成一种保护性的二氧化硅水化层。
[〇〇34]如疫苗矿化能力有限，可选择在疫苗表面吸附外源带正电的大分子或多肽作为二氧化硅成核矿化诱导分子，具体步骤如下:
[0035]1)向疫苗液加入带正电荷的大分子孵育，再加入新制备的硅酸或硅酸盐，调节溶液pH值至中性，即为初始体系；
[0036]2)将所述初始体系进行孵育；
[0037]3)孵育后，即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗，所述的热稳定疫苗表面具有非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅的复合物组成的水合表层。
[0038]其中，所述步骤1)调节溶液pH值的目的是通过静电相互作用在疫苗表面吸附一层富含正电的大分子作为成核诱导基团，二氧化硅纳米簇在疫苗表一种保护性的有机-无机复合的二氧化硅水化层。所述的有机-无机复合层可为鱼精蛋白-水合态二氧化硅复合物、R5肽-水合态二氧化硅复合物、聚乙烯亚胺-水合态二氧化硅复合物。进一步地，所述步骤的1)中加入的带正电荷的大分子的浓度为20?400mg/L，优选为200mg/L。
[0039]进一步地，以上两种方法所述步骤1)的pH值可为5.5?8.0,优选的pH值为6.0 ?7.0〇
[0040]进一步地，以上两种方法所述步骤1)的所述硅酸或硅酸盐的浓度可为2?30mM，优选的浓度为2?5mM，进一步优选的浓度为3mM。
[0041]进一步地，以上两种方法所述步骤1)的疫苗液体系中，疫苗与硅酸或硅酸盐的配比可为 lg/L(109-10nPFU): 2-5mM(优选为 3mM)。