用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品制造技术领域，尤其是涉及用于鸭病毒性肝炎活疫苗的 耐热冻干保护剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV ;属于小核糖核酸病毒）引起的雏鸭的一种以肝脏出血性炎症为特征的急性、烈 性、高度致死性传染病。临床表现为痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝脏肿胀、出血为 特征性病变。雏鸭感染后的死亡率可达90 %~95%，已经成为危害养鸭业的主要疾病之 一，会造成养鸭业极大的经济损失。
[0003] 鸭肝炎病毒（DHV)有4个独立的血清型，1型、2型、3型和新型。范书才等（范书 才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报，2009, 10)通过试验 证明目前在我国同时存在1型和新型DHV流行。血清中和试验表明，1型和新型之间缺乏交 叉保护作用。在4个型的DHV中，1型与新型DHV流行最广泛，毒力最强；对3周龄内的雏 鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国，3型仅在美国有报道；二者均呈散发性流行， 致死率低（约20% )。近年来我国大陆、台湾及韩国分别有1型DHV变异株和新型鸭肝炎 的报道，不同学者通过分子生物学和血清学试验证实我国虽有鸭肝炎变异株或新型鸭肝炎 的存在，但鸭肝炎的流行仍以经典的1型肝炎为主。
[0004] 目前我国鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总量的70%以上。此前，我 国对鸭病毒性肝炎的防治主要加强消毒和常规疫苗免疫，由于被动免疫持续时间短，预防 和治疗效果不佳，常常需要多次免疫，造成防治费用高、费时费力。鸭病毒性肝炎活疫苗是 预防本病最经济和最有效的方法。
[0005] 鸭肝炎病毒属小RNA病毒，无脂蛋白包膜，一般不耐受冷冻干燥。目前，鸭病毒性 肝炎活疫苗在2°C~8°C条件下的保存期只有3~6个月，大多需要在-15°C以下保存。因 此，鸭病毒性肝炎活疫苗在长期保存和长途运输过程中需要严格控制温度，不仅成本较高， 而且增加了疫苗失效的风险。现有技术中，鸭病毒性肝炎活疫苗常用的耐热冻干保护剂的 主要成分是乳糖、牛奶、明胶等，虽然组方简单、产品外形稳定、易溶性好、成本低，但在冷冻 干燥及高温储存过程中对抗原活性保护能力较差。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂，在冷冻干燥及 高温储存过程中能够高效保护抗原活性，而且成本较低、对鸭安全。
[0007] 本发明的另一目的是提供耐热冻干保护剂的制备方法，该方法操作方便、安全。
[0008] 本发明的再一目的是提供上述耐热冻干保护剂在制备鸭病毒性肝炎活疫苗方面 的应用，制备的鸭病毒性肝炎活疫苗，其病毒含量几乎与湿毒相当，能够耐受较高温度储 存。
[0009] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂，含有下述成分：蔗糖70~100g/L、 普鲁兰糖1~l〇g/L、明胶6~10g/L、还原型谷胱甘肽10~20g/L、磷酸氢二钾10~20g/ L、磷酸二氢钾5~10g/L、牛血清白蛋白10~30g/L、甲硫氨酸10~20g/L。
[0011] 在本发明中，所述耐热冻干保护剂的溶剂为无菌的生理盐水、注射用水、PBS缓冲 液、Tris-HCl缓冲液或Hank' s液。缓冲液的pH选择7. 0~7. 5。
[0012] 本发明还提供所述耐热冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)将含有蔗糖、明胶和普鲁兰糖的溶液，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；
[0014] (2)将含有还原型谷胱甘肽、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白和甲硫氨酸 的溶液，采用过滤法进行除菌；
[0015] (3)将步骤（1)和（2)所得溶液混合，得到所述耐热冻干保护剂。
[0016] 本发明还提供所述耐热冻干保护剂在制备鸭病毒性肝炎活疫苗方面的应用以及 采用所述耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗。
[0017] 本发明还提供所述鸭病毒性肝炎活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将耐热冻干 保护剂和鸭肝炎病毒液按照体积比为〇. 5~1. 5:1混合，冷冻干燥后得到所述鸭病毒性肝 炎活疫苗。
[0018] 在本发明中，所述冷冻干燥方法如下：将耐热冻干保护剂和鸭肝炎病毒液的混合 物放入真空干燥机内，在常压、0~6°C条件下预冷20~40min，然后按照0. 2~0. 5°C /min 的速度降温至-38~-42°C并维持2~5h，抽真空至300~500mTorr，然后以0. 02-0. 04°C / min的速度升温至-18~-22°C并维持1. 5~3h，再以0. 4~0. 6°C /min的速度升温至20~ 24°C并维持5~7h。
[0019] 在本发明中，鸭肝炎病毒为1型、2型、3型或新型。
[0020] 经过多次试验发现，分子量在10000-20000范围内的普鲁兰糖均可以用于制备本 发明耐热冻干保护剂，且对抗原活性的保护效果相似。
[0021] 与现有技术相比，本发明用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂具有以下优 势：
[0022] (1)本发明耐热冻干保护剂在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活 性，而且对鸭是安全的，有效解决了疫苗在保存、运输中的低温冷链问题，尤其是解决了偏 远地区农村低温冷链问题；同时还降低了疫苗保存、运输的成本。
[0023] (2)本发明耐热冻干保护剂，制备过程操作方便，安全。采用本发明耐热冻干保护 剂制备鸭病毒性肝炎活疫苗，冻干时间短。由于本发明耐热冻干保护剂的主要成分主为蔗 糖，避免使用大量海藻糖，有效降低鸭病毒性肝炎活疫苗的冻干成本。
[0024] (3)米用本发明耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗，其病毒含量 几乎与湿毒相当，能够耐受较高温度储存，37 °C储存10d病毒含量仅为损失10°·33~ 10°'呷0)5。/0.11111，37°(：储存30(1病毒含量损失仅为10(161~10 (1呷0)5。/0.11111，显著低于对 照疫苗。因此，采用本发明耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗将大大降低制备、储 存成本，降低失活风险。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1制备鸭肝炎病毒液
[0026] 取生产用鸭肝炎病毒1型A66株，用灭菌生理盐水作100倍稀释，接种发育良好 的9~10d SPF鸡胚尿囊腔，每胚0. 2ml，封孔后，置37°C继续孵育，弃去24h内死亡的鸡 胚，每隔4h照胚一次，及时收获24~72h死亡的鸡胚，置4°C冷却24h后，取出用碘酊消毒 气室，以无菌手术剪除去蛋壳，收获病变鸡胚绒毛尿囊膜、胚液（尿囊液及羊水）、胚体并混 合，高速匀浆制成悬液，作为鸭肝炎病毒液。将鸭肝炎病毒液置于灭菌容器中，加入终浓度 为10000U/ml青霉素和10mg/ml链霉素，作用1~2h，留样后置于-80°C冻结保存。经检验 无菌，病毒含量多l(f5ELD5Q/0. lml，方可用于配苗。
[0027] 实施例2制备耐热冻干保护剂
[0028] 本实施例中普鲁兰糖分子式为(：3品203。，分子量为10000。牛血清白蛋白缩写为 BSA〇
[0029] 1.耐热冻干保护剂A
[0030] 耐热冻干保护剂A含有下述成分：蔗糖70g/L、普鲁兰糖lg/L、明胶6g/L、还原型 谷胱甘肽l〇g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾5g/L、BSA10g/L、甲硫氨酸10g/L，溶剂为 pH7.2、20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。
[0031] 耐热冻干保护剂A的制备方法，包括如下步骤：
[0032] (1)以 pH7. 2、20mmol/L Tris-HCl 缓冲液为溶剂，配制含有 140g/L 蔗糖和 12g/L 明胶、2g/L普鲁兰糖的溶液，在110°C条件下进行高压蒸气灭菌20min ;
[0033] (2)以ρΗ7· 2、20mmol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制含有20g/L还原型谷胱 甘肽、20g/L磷酸氢二钾、10g/L磷酸二氢钾、20g/LBSA和20g/L甲硫氨酸的溶液，采用 0. 22 μ m的滤膜除菌；
[0034] (3)将步骤⑴和⑵所得溶液按照体积比为1:1混合，得到耐热冻干保护剂A。
[0035] 2.耐热冻干保护剂B
[0036] 耐热冻干保护剂B含有下述成分：蔗糖85g/L、普鲁兰糖5g/L、明胶8g/L、还原型 谷胱甘肽15g/L、磷酸氢二钾15g/L、磷酸二氢钾5g/L、BSA 20g/L、甲硫氨酸15g/L，溶剂为 生理盐水。制备方法参照耐热冻干保护剂A。
[0037] 3.耐热冻干保护剂C
[0038] 耐热冻干保护剂C含有下述成分：蔗糖100g/L、普鲁兰糖10g/L、明胶10g/L、还原 型谷胱甘肽20g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾10g/L、BSA 30g/L、甲硫氨酸20g/L，溶剂 为pH7.5、20mmol/L Tris-HCl缓冲液。制备方法参照耐热冻干保护剂A。
[0039] 实施例3
[0040] 为更好的设定冻干曲线，将耐热冻干保护剂B (实施例2制备）分别与生理盐水和 鸭肝炎病毒液（实施例1制备）按照体积比1:1混合，测定塌陷温度、共晶点和共溶点。
[0041] 表1耐热冻干保护剂B的塌陷温度、共晶点和共溶点
[0044] 从表1可以看出，耐热冻干保护剂B的塌陷温度为-34~-35°C ;共晶点温度 为-23. 8~-24°C ;共熔点温度为-24. 6~-24. 8°C，参照此条件设定最佳冻干工艺。
[0045] 实施例4鸭病毒性肝炎活疫苗的制备
[0046] 分别用耐热冻干保护剂A、B和C制备鸭病毒性肝炎活疫苗。
[0047] 鸭病毒性肝炎活疫苗A的制备：取耐热冻干保护剂A与鸭肝炎病毒液（实施例1制 备）按照体积比为1:1混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基胶塞半加塞后，置入冻干 机箱体内进行冷冻干燥。具体方法如下：在常压、4°C条件下预冷30min，以0. 37°C /min的 速度将温度降至_40°C，然后在_40°C条件下维持2. 5h使疫苗冻实；抽真空至500mTorr，再 以0. 03°C /min的速度将温度逐步升直至-20°C，在_20°C条件下维持2小时；再以0. 5°C / min的速度升温至22°C，在22°C条件下维持6h，加塞出箱，冻干全程为25h。
[0048] 鸭病毒性肝炎活疫苗B的制备：取耐热冻干保护剂B