牛膝皂苷在制备预防肿瘤转移药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体设及牛膝皂巧在制备预防肿瘤转移药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一种对人类生命有严重危害的众多疾病之一，由于现代社会人们生活 习惯改变、环境污染加剧、食品中含有不良化学添加剂等因素的影响发病人数呈现逐年上 升趋势。恶性肿瘤一旦发生转移，会大大提高病人的死亡率。
[0003]肿瘤的转移是指肿瘤细胞从身体癌变部位出发，迁移到身体其他部位。在运一过 程中能够看到对肿瘤转移起关键作用的是细胞间和细胞-外基质之间的黏附、基底膜的降 解、细胞的迁移情况(定向迁移)、血管的形成状况W及细胞外的基质情况和微环境。抑制并 调控肿瘤的转移就必须寻找出能够切断肿瘤转移过程的药物，中草药作为一种具有较低毒 副作用的药物，在预防肿瘤及转移方面具有天然优势，同时还能够提高机体的免疫功能。因 此，从中草药中寻找预防肿瘤细胞转移的新药具有深远意义。
[0004]中药牛膝是我国的传统中药，有着悠久的历史，始载于《神农本草经》，被列为上 品。《中国药典》中收载的牛膝品种有两种，即宽科牛膝属植物的怀牛膝(学名 Aiofen紅紅B1.)和杯宽属的川牛膝(学名：分別如知旧知5足化?打)。
[0005]怀牛膝是宽科牛膝属多年生草本植物牛膝的干燥根，味甘苦酸，性平，入肝、肾经。 其主要化学成分有皂巧类、酱酬类、糖类、黄酬类、生物碱类等，W及多种微量元素。现代药 理表明其具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等功效。
[0006]川牛膝为宽科杯宽属多年生草本植物川牛膝的干燥根，性平、味甘、微苦。其化学 成分W酱酬类、多糖类、皂巧类、异黄酬类等为主。现代药理研究表明，川牛膝在抗炎、抗肿 瘤、增强免疫等方面有明显的作用。
[0007]牛膝的抗肿瘤作用主要是通过调节机体免疫机制W及改变细胞膜生活特性来实 现的，其对多种免疫细胞具有活性，从而提高免疫因子的表达，增强机体的体液免疫。Li Qin-Lin等人研究发现，C57化/6小鼠体内的肺癌细胞在低剂量的牛膝多糖下，肺癌细胞的 增长得到明显的抑制。但牛膝皂巧类在肿瘤转移方面的作用目前还未有报导。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供牛膝皂巧在制备预防肿瘤转移药物中的应用。
[0009]牛膝皂巧在制备预防肿瘤转移药物中的应用。
[0010] 所述牛膝皂巧制备方法为将怀牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末；取牛膝粉末 2邑，加入40mL70%乙醇溶液回流提取2次，每次回流提取3小时，抽滤，合并滤液；得到的滤 液用旋转蒸发仪旋蒸至无乙醇，加入20mL纯水超声分散后抽滤，收集滤液；依次加入等体 积的石油酸、水饱和正下醇分别萃取3次；正下醇层旋蒸至干，加入1-5mL纯水超声溶解， D101大孔吸附树脂上样，依次W3倍体积的水、20%乙醇、80%乙醇、95%乙醇溶液分别进行 洗脱；收集80%乙醇洗脱部分，旋蒸至干，得到牛膝皂巧提取物。
[0011] 所述药物剂型包括：片剂、胶囊剂、滴丸、口服液、颗粒剂、缓释剂。
[001引包括内容有： (1)将怀牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末，经乙醇回流、乙酸萃取、水饱和的正下醇 萃取及大孔树脂分离后得到相应牛膝皂巧提取物。
[0013] (2)所述牛膝皂巧对人结肠癌细胞（HT-29)的生长增殖有一定抑制作用，并且对 HT29细胞迁移运动具有明显的抑制作用，而且怀牛膝皂巧的抑制作用优于川牛膝皂巧。另 夕F，牛膝皂巧还可抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞对人厮静脉内皮细胞（HUVEC)的黏附。牛 膝皂巧提取物具有较低的细胞毒性，并且有明显的抗肿瘤细胞运动迁移转移能力和抗肿瘤 细胞粘附能力，符合肿瘤转移预防药物的基本特点。
[0014] 本发明的优点在于：牛膝药材(包括：怀牛膝和川牛膝）中提取的皂巧成分具有明 显的抗细胞迁移、粘附血管的能力和较低的细胞毒性，不同于现有细胞毒抗癌药物，因此可 望开发适合长期服用的肿瘤转移预防药物。本发明拓展了牛膝皂巧类提取物的应用，也为 肿瘤转移的预防提供了新思路和新方法。
【附图说明】
[001引图1不同浓度的怀牛膝皂巧（AB)和川牛膝皂巧（RC)作用0h，24h，48h及72h下，HT-29细胞的生长增殖情况。
[0016] 图2Transwell实验考察50yg/mL怀牛膝皂巧和川牛膝皂巧处理24小时后，对 HT-29细胞迁移运动能力的影响。
[0017] 图3Transwell实验考察50yg/mL怀牛膝皂巧和川牛膝皂巧处理48小时后，对 HT-29细胞迁移运动能力的影响。
[0018] 图4用50yg/mL怀牛膝皂巧或川牛膝皂巧处理48小时，对MDA-MB-231乳腺癌 细胞人厮静脉内皮细胞（HUVEC)上黏附的影响。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。
[0020] 实施例1怀牛膝和川牛膝皂巧的提取方法 将怀牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末。取牛膝粉末2g，加入40mL70%乙醇溶液回 流提取2次，每次回流提取3小时，抽滤，合并滤液。得到的滤液用旋转蒸发仪旋蒸至无乙 醇，加入20mL纯水超声分散后抽滤，收集滤液。依次加入等体积的石油酸、水饱和正下醇 分别萃取3次。正下醇层旋蒸至干，加入3血纯水超声溶解，D101大孔吸附树脂上样，依次 W3倍体积的水、20%乙醇、80%乙醇、95%乙醇溶液进行洗脱。收集80%乙醇洗脱部分，旋 蒸至干，得到牛膝皂巧提取物。该皂巧提取物的水溶液在用力振摇下，产生持久性蜂窝状泡 沫。
[0021] 实施例2怀牛膝和川牛膝皂巧对人结肠癌细胞的增值抑制作用 收集对数期HT-29细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100yL铺板使待测细胞调密度 2000/孔。解育条件为：5%浓度的0)2, 37°C，在此条件下使细胞单层铺满孔底（96孔平底 板)，向其中加入怀牛膝皂巧、川牛膝皂巧浓度分别为1yg/mL、10yg/mL、50yg/mL、100yg/mL，每孔200化，设3-5个复孔。解育时间选择0h、6h、24h、48h、72h小时后进 行MTT检测。每孔加入10yLMIT溶液（5mg/mU即0.5%MTT)，继续培养4h后终止培 养，小屯、的去孔内部的培养液。每孔加入150iiL二甲基亚讽，放置于摇床之上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪选择波长492nm处测量各孔的吸光值。
[002引 细胞存活率（1%)的计算方法如下：1% =(A-A0)/ (A1 -A0)X100% 式中：A-一受测试样组OD值； A1--溶剂对照组OD值； A