一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界上禽蛋禽肉生产的大国，位居世界第一、第二，由于目前国内市场的消费日趋满足，能否出口就成为制约我国养禽业发展的重要问题。其中，疫病控制及免疫预防中的药物残留问题是主要根源。在鸡的所有疫病中，传染性疾病可占到60%?70%，仍然是危害养鸡业的最重要的疾病。因此，要想发展养鸡业必须控制鸡病毒性免疫抑制性疾病，我国未来养殖业的发展方向，应该实现由污染的环境、高昂的成本、低劣的产品，向环保、节能和生产大量绿色安全食品的转变。作为绿色环保的生物性免疫增强剂一一特异性转移因子，以其无抗原性、无毒副作用等特点，已在畜牧业上得到了广泛的应用，并有取代抗生素和抗体的趋势。特异性转移因子是一种具有较强免疫活性的小分子物质，吸收快，作用迅速，无不良反应和毒副作用。由于其有抗原特异性和多方面的非特异性免疫功能，是一种理想的动物免疫增强制剂。
[0003]免疫增强制剂的制备方法主要采用透析-过柱法、超滤-过柱法或单纯透析法，如曾仕廉等报道，将细胞置于_50°C冻结，再置于37°C水浴融化，如此反复冻融6次，4000r/min低温冷冻离心，上清液经中空纤维超滤器超滤，截留相对分子质量5000的超滤液，再采用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。李富桂等报道，将组织置于组织捣碎机中粉碎匀浆后，用超声波裂解组织细胞，再于4000r/min离心20min。弃去沉淀，将上清液装入透析袋，搅拌透析48h，收集透析外液，蛋白质检测为阴性，再将透析外液用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。江青艳等、日穆德玛等和马凤龙等报道，用无菌盐水洗净组织，在无菌条件下搅碎、称重，加1.5倍双蒸馏水制成匀浆，冻融9次，3000r/min离心30min，取上清液用透析袋进行透析，温度为4°C，磁力搅拌透析48h。以上介绍的免疫增强制剂的制备方法，工艺繁琐，多肽产量低，不适合大规模批量生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0006]—种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤:
[0007]步骤1、免疫健康猪:取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫；
[0008]步骤2、原材料预处理:采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；
[0009]步骤3、组织匀浆的制取:将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4°C的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；
[0010]步骤4、反复冻融:将步骤3制取的组织匀浆于_70°C快速冷冻，之后再在30°C左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4°C以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4°C以3000-4000r/min离心20-30分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；
[0011]步骤5、超滤:将步骤4所得混合滤液用截流值为1KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
[0012]步骤6、除菌:将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂。
[0013]本发明的特点还在于，在步骤I中，所用鸡目的疫苗选自鸡新城疫疫苗、鸡传染性法氏囊炎疫苗。
[0014]本发明的特点还在于，在步骤I中，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下:
[0015]对选择的健康猪利用目的疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头。
[0016]本发明的特点还在于，在步骤I中，所选健康猪无传染病和寄生虫病，所选健康猪的体重约100kg。
[0017]本发明的特点还在于，在步骤6中，所用滤膜的孔径为0.22um。
[0018]本发明的有益效果如下:
[0019]本发明提供的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，采用预处理和超滤等方法对传统的制备工艺进行改良，工艺简单，产品的生物活性好，多肽产量高。结果改良工艺后平均多肽含量为3.27g/L，明显高于传统工艺平均多肽含量1.25g/L，提高近2.6倍，测定其生物活性亦比原工艺制备明显提高。利用本发明制备的鸡特异性免疫增强剂具有很好的市场利用前景，生产流程既简便又高效，大规模生产后可更加广泛的在兽医临床上应用，可以有效的预防和控制鸡病毒性疾病的发生与流行，从而减少此类疾病给养禽业带来的巨大的经济损失，以实现更好的企业效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021]实施例1
[0022]本发明实施例的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，按照如下步骤进行:
[0023]步骤1、免疫健康猪:选取无传染病和寄生虫病的健康猪，体重约100kg，取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫，所用鸡目的疫苗选自鸡新城疫疫苗，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下:
[0024]对选择的健康猪利用鸡新城疫疫苗进行皮下多点注射进行免疫，免疫共进行4次，每次免疫间隔一周，4次免疫的免疫剂量依次为50羽/头、100羽/头、200羽/头、500羽/头；
[0025]步骤2、原材料预处理:采集免疫成功后猪的脾、胸腺及淋巴结，用纯化水洗净猪脾、胸腺及淋巴结，去其表面的筋膜及脂肪等组织，再用灭菌生理盐水反复冲洗；
[0026]步骤3、组织匀浆的制取:将步骤2所得洗干净的猪脾脏、胸腺及淋巴结剪碎，加入3倍体积的生理盐水，在4°C的条件下用胶体磨磨细，制得组织匀浆；
[0027]步骤4、反复冻融:将步骤3制取的组织匀浆于_70°C快速冷冻，之后再在30°C左右进行水浴融化，按照此冷冻和融化的方式共重复进行五次，然后通过冰冻离心机于4°C以3000r/min离心30分钟，取上层红色液体，离心渣再用2倍的生理盐水稀释，再用胶体磨磨细，置于冰冻离心机于4°C以3000r/min离心30分钟，取上层红色离心液体，将两次滤液混合在一起；
[0028]步骤5、超滤:将步骤4所得混合滤液用截流值为1KD的超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于6000道尔顿的转移因子；
[0029]步骤6、除菌:将步骤5超滤得到的滤液用滤膜加压过滤除菌，即得鸡特异性免疫增强剂，所用滤膜的孔径为0.22um。
[0030]实施例2
[0031]本发明实施例的一种鸡特异性免疫增强剂的制备方法，按照如下步骤进行:
[0032]步骤1、免疫健康猪:选取无传染病和寄生虫病的健康猪，体重约100kg，取鸡目的疫苗作为抗原，对健康猪进行目的疫苗强化免疫，所用鸡目的疫苗选自鸡传染性法氏囊炎疫苗，对健康猪进行目的疫苗强化免疫的过程如下:
[0033]对选择的健康猪利用