癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及癫痫宁的新用途，具体涉及癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药 物中的应用，属于中医药领域。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alazheimer's disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆损伤 为主的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行 功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。目前用于治疗阿尔茨海默病的药 物主要分为两类：乙酰胆碱酯酶抑制剂（如加兰他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA 受体）拮抗剂（如美金刚），但上述药物价格昂贵、副作用显著（幻觉、意识混沌、头晕、头痛 和疲倦），且只能控制却不能逆转患者病情。
[0003] 现代医学对阿尔茨海默病的发病机制进行了多年的研究，但是由于其病因复杂， 该病的发病机制至今仍不明确。目前较为主流的学说是(6-淀粉样蛋白（AP)学说，该学 说的核心是患者大脑中异常沉积的AP通过自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等一 系列级联反应，直接或者间接作用于神经元和神经胶质细胞，最终导致神经元功能异常或 者死亡，引发认知损伤及记忆衰退，最终引起痴呆。
[0004] 阿尔茨海默病患者的大脑皮层和海马出现P淀粉样蛋白（AP)聚集形成的老年 斑（SP)是阿尔茨海默病最为主要病理特征之一，(6-淀粉样蛋白可以有效削弱突触结构和 功能，是引起阿尔茨海默病的重要物质。因此0淀粉样蛋白已成为公认的筛选预防或治疗 阿尔茨海默病药物的靶标。
[0005] 阿尔茨海默病病因复杂且发病环节较多，目前西药针对阿尔茨海默病的某一特定 病理环节进行干预往往会出现耐药及严重不良反应。而中药具有多种活性成分、多靶点的 作用特征，使中药治疗阿尔茨海默病具有明显的优越性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供癫痫宁的一种新用途，具体涉及癫痫宁在制备预防或治疗 阿尔茨海默病药物中的应用。
[0007] 所述的癫痫宁剂型可以为片剂、丸剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂。剂型不同不影响 癫痫宁在预防或治疗阿尔茨海默病方面的功能。
[0008] 本发明公开的所述的癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述 的癫痫宁为癫痫宁片。
[0009] 癫痫宁片剂是由蜘蛛香、石菖蒲、钩藤、牵牛子、千金子、缬草、甘松、薄荷脑八味药 经过现代制药工艺精制而成的中成药。目前，癫痫宁用于风痰上扰癫痫病，或用于癔病、失 眠等。
[0010] 本发明将转基因秀丽线虫株系CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物的 病理模型来评价癫痫宁预防或治疗阿尔茨海默病的作用，是基于：阿尔茨海默病患者的大 脑皮层和海马出现0淀粉样蛋白（AP)聚集形成的老年斑（SP)是阿尔茨海默病最为主要 病理特征之一，(6-淀粉样蛋白可以有效削弱突触结构和功能，是引起阿尔茨海默病的重要 物质。转基因秀丽线虫品系CL4176在25°C温度诱导下肌肉特异性表达人类在肌 肉组织聚集，最终导致线虫麻痹。将药物作用于线虫株系CL4176,如果线虫群体麻痹状况得 到改善，具体表现为线虫的麻痹时间显著延滞，则说明药物具有预防或治疗阿尔茨海默病 作用。
[0011] 秀丽隐杆线虫对外界环境变化反应敏感，利用秀丽线虫可以对药物的毒性进行准 确评价，体长是最为常用的发育毒性评价指标之一。药物作用于线虫后，如果线虫体长显著 减小，则说明药物对线虫具有显著的发育毒性。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0013] 本发明评估癫痫宁对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的作用，结果证实 了癫痫宁对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型具有明显的抑制作用，具有预防或治 疗阿尔茨海默病的潜力。
[0014] 因此，中成药癫痫宁可用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的描述。
[0016] 图1为阳性药物盐酸美金刚对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的影响。
[0017] 图2为癫痫宁片对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的影响。
[0018] 图3为蜘蛛香、石菖蒲、钩藤及其癫痫宁片的药效评价实验结果。
[0019] 图4为蜘蛛香与癫痫宁片的毒性评价实验结果。
【具体实施方式】
[0020] 以下提供具体实施例以实现本发明所述的癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默 病药物中的应用，但不限于这些实施例。
[0021] 实施例一盐酸美金刚对秀丽隐杆线虫CL4176的作用
[0022] 1 ?生物材料
[0023] (1)秀丽隐杆线虫 CL4176 购自 Caenorhabditis Genetics Center ;为转基因品 系，在25°C温度诱导下肌肉特异性表达人类A P，A P在肌肉组织聚集，最终导致线虫麻痹， 本实施例采用秀丽线虫品系CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物的病理模型。
[0024] (2)大肠杆菌0P50 (尿啼啶渗漏突变株），购自CaenorhabditisGenetics Center，作为秀丽隐杆线虫的食物。
[0025] 2?试剂
[0026] (1)盐酸美金刚（MEM)，化学名称：1_氨基_3,5_二甲基金刚烷胺盐酸盐，分子式： C 12H21N ^HCl,购自百灵威科技，CAS :41100-52-1 ;盐酸美金刚为非竞争性NMDA受体拮抗剂， 用于治疗中重度至重度阿尔茨海默型痴呆，文献报道美金刚（2. 16mg/ml)能够显著抑制转 基因线虫株系CL4176麻痹表型，本实施例将其作为阳性药物。
[0027] (2)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作（以1升为例）：
[0028]
[0029] 固体NGM培养基配制好后，121°C下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入 5mg/ml胆固醇lml，IM MgSO4 lml, IMCaCl2 Iml,摇勾，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约 20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。
[0030] (3)配制含盐酸美金刚的NGM培养基
[0031] 盐酸美金刚溶解于无菌水中，配制成为2. 16mg/ml的母液；将美金刚母液加 入融化的NGM培养基中，配制为含盐酸美金刚终浓度为215. 76 y g/ml、107. 88 y g/ml、 21. 58 y g/ml、4. 32 y g/ml、0. 86 y g/ml 的 NGM 培养基。
[0032] 空白对照为同样条件下加入与盐酸美金刚等体积无菌水的NGM培养基。
[0033] 上述培养基上均涂布大肠杆菌0P50作为线虫的食物。
[0034] (4) M9 液配方
[0035]
[0036] (5)裂解液的配制：6. 4%NaClO3溶液和IMNaOH溶液按体积比1:1混合。
[0037] 3?实施步骤
[0038] (1)线虫的培养：
[0039] 将线虫接在涂有大肠杆菌0P50的固体NGM板上，然后置于16°C的培养箱中培养， 当线虫长到成虫时进行同步化处理。
[0040] ⑵线虫同步化：
[0041] 挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培 养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心 管中加入线虫碱裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋，并分 装于I. 5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。
[0042] (3)盐酸美金刚（MEM)对秀丽隐杆线虫CL4176的作用
[0043] 线虫同步化后将线虫卵转移到涂布有0P50并混合不同浓度盐酸美金刚的NGM培 养基上，空白对照为涂布有0P50并加有与盐酸美金刚等体积无菌水的NGM培养基。每个培 养基60条线虫，每个药物浓度以三个培养基作为平行，16°C培养3天至L3期。
[0044] 为了使线虫表达六!]，将L3期线虫转至25°C下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹 条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹（麻痹是指机械刺激线虫身体时，线虫不能 运动或者只有头部运动），结果见图1。
[0045] 由图1可以看出，水溶解的阳性药物盐酸美金刚在21.58μg/ml、4.32μg/ml、 0. 86 y g/ml时能够显著抑制CL4176麻痹表型，215. 76 y g/ml和107. 88 y g/ml盐酸美金 刚强烈抑制线虫发育。实验结果表明本实验体系正常，说明本发明能够采用秀丽线虫品系 CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物。
[0046] 实施例二癫痫宁片对秀丽隐杆线虫CL4176的作用
[0047] 1.生物材料同实施例一。
[0048] 2?试剂
[0049] (1)癫痫宁片：生产厂家：昆明中药厂，批准文号：国药准字Z53020771。
[0050] (2)固体NGM(NematodeGrowthMedium)培养基成分与制作（以1升为例）：同实 施例一。
[0051] (3)配制含水溶解的癫痫宁片NGM培养基
[0052] 火焰加热癫痫宁片，剥去糖衣。将癫痫宁片用研钵研成粉末，溶解于无菌水中，并 配置成为150mg/ml癫痫宁片水溶液，室温下超声30min，并于1000 Orpm下离心10min，取上 清，于