黑果枸杞果实提取物在制药中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黑果枸杞果实提取物的新用途，具体涉及在制备治疗干燥综合征 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 干燥综合征（Sj6grert'ssyndrome, SS)是一种主要侵犯外分泌腺的慢性系统性自 身免疫性疾病。该病最常见的临床表现为进行性口干、眼干，同时可累及肾、肺、甲状腺和肝 等多种器官，出现高球蛋白性紫癜、间质性肺炎、肾小管酸中毒、胆汁性肝硬化、外周及中枢 神经损伤等表现。本病分为原发性和继发性两类，不合并其他自身免疫性疾病者称为原发 性干燥综合征（primary SS，pSS);继发于类风湿关节炎（RA)、系统性红斑狼疮（SLE)等为 继发性干燥综合征（secondary SS，sSS)。SS女性多发，约占全部病例的90%，发病年龄集 中于30~60岁。流行病学调查显示，该病在我国人群患病率为0. 29%~0. 77%，在老年 群体中患病率为3%~4%。是最常见的结缔组织病之一，目前尚无肯定的药物改变其病程 (华红，干燥综合征西医、中医治疗研究进展，中国实用口腔科杂志，2012, 5 (3)，142-145.)。
[0003] 干燥综合征的病理机制尚不明确，多种动物模型被用来研究干燥综合征的病理 过程，其中NOD小鼠模型被认为目前比较适宜的干燥综合征动物模型（高春鹤，刘维.干 燥综合征NOD小鼠模型研究进展，中国实验动物学报，2008, 16 (1)，65-69)。水分子通道蛋 白-5 (AQP5)是细胞跨膜转运蛋白之一，具有高通透性，通过此通道水可以经过质膜向高渗 方向快速移动。在SS的发病机制中，目前只有AQP5证实与唾液分泌功能密切相关。AQP5 在SS涎腺及泪腺组织定位明确，其转运分布的异常，均能导致腺体破坏及M3R的异常，引起 口眼干等症状。故可以通过AQP5途径刺激增加腺体分泌，改善SS 口干等症状，达到治疗SS 的目的（刘燕，钱先.AQP5在干燥综合征发病机制中作用研究进展，辽宁中医药大学学报， 2014,16(1)，85-87)。
[0004] 黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.)系爺科枸杞属多年生耐盐抗旱灌木植物， 主要生长于我国西北高原地区的盐碱荒漠地带，藏药称其果实为"旁玛"，据《四部医典》和 《晶珠本草》等藏医药经典著作记载，可用于治疗心热病、心脏病、月经不调和停经等病症。 天然花青素类化合物由于可清除人体内代谢过程中产生的过多自由基，具有较强的防止活 性氧危害及抗氧化活性，对于疾病的防治起着重要作用。
[0005] 目前还没有文献关于黑果枸杞果实及其提取物用于治疗干燥综合征的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是公开一种黑果枸杞果实提取物在制药中的应用，以满足临床应用 的需要。
[0007] 动物试验证明，所述的黑果枸杞果实提取物，对于所述的干燥综合征具有明显的 治疗和改善效果，可以用于制备治疗干燥综合征药物。
[0008] 所述的黑果枸杞果实提取物，可以根据我们此前申请的专利（专利名称：黑果枸 杞果实提取物及制备方法和应用，【申请号】201310274771. 5)所公开的技术进行制备，具体 的包括如下步骤：
[0009] (1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1~2%。酸的水溶液，温度10~60°C 搅拌提取，提取时间为1~3小时，优选提取1~3次，每次0. 5~1小时，过滤收集提取 液；
[0010] 酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8~12倍；
[0011] 所述的酸选自盐酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、草酸或磷酸；
[0012] (2)吸附：将步骤（1)中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔树脂的 层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性充分吸附；
[0013] (3)洗脱：先用水洗脱步骤（2)中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱 液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
[0014] 所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
[0015] 酸 0? 1 ~2%〇
[0016] 体积浓度为75 %的乙醇水溶液 余量
[0017] 洗脱液的重量用量为步骤（1)中黑果枸杞果实重量的15~20倍；
[0018] 所述的酸为盐酸、醋酸或柠檬酸；
[0019] (4)浓缩：将步骤（3)中所得洗脱液于50~60°C条件下减压浓缩回收乙醇，直至 25°C时的溶液密度为I. 1~1. 2,得黑果枸杞果实提取物浸膏；
[0020] (5)干燥：将步骤（4)中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得所述黑 果枸杞果实提取物。
[0021] 上述的黑果枸杞果实提取物，含有：矮牵牛单宁（petanin)的重量含量为14%~ 18% 〇
[0022] 结构式如下：
[0023]
[0024] 优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：
[0025] (1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为2%。盐酸的水溶液，在温度60°C搅拌 提取三次，每次0. 5小时，过滤收集提取液；
[0026] 盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；
[0027] (2)吸附：将步骤⑴中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔树脂的 层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性吸附；
[0028] (3)洗脱：先用水洗脱步骤（2)中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱 液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
[0029] 洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
[0030] 酸 2%〇
[0031 ] 体积浓度为75 %的乙醇水溶液 余量
[0032] 洗脱液的重量用量为步骤（1)中黑果果实的20倍；
[0033] 所述的酸为盐酸；
[0034] (4)浓缩：将步骤⑶中所得洗脱液于60°C条件下减压浓缩回收乙醇，直至25°C 时的溶液密度为1. 1，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
[0035] (5)干燥：将步骤⑷中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸 杞果实提取物；其中：矮牵牛单宁（petanin)的重量含量为16. 33%。
[0036] 进一步优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：
[0037] (1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1%。柠檬酸的水溶液，在温度KTC搅 拌提取三次，每次1小时，过滤收集提取液；
[0038] 酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的12倍；
[0039] (2)吸附：将步骤⑴中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯一二乙烯苯大孔树脂的 层析柱，使黑果枸杞提取液得到选择性吸附；
[0040] (3)洗脱：先用水洗脱步骤（2)中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱 液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
[0041] 洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
[0042] 酸 0? 1%0
[0043] 体积浓度为75 %的乙醇水溶液 余量
[0044] 洗脱液的重量用量为步骤（1)中黑果枸杞果实的15倍；
[0045] 所述的酸为柠檬酸；
[0046] (4)浓缩：将步骤（3)中所得洗脱液于60°C条件下减压浓缩回收乙醇，直至25°C 时的溶液密度为1. 2,得黑果枸杞果实提取物浸膏；
[0047] (5)干燥：将步骤（4)中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸 杞果实提取物，其中：矮牵牛单宁的重量含量为：15. 5%。
[0048] 进一步，所述的药物，包括治疗有效量的所述的黑果枸杞果实提取物和医药学上 可接受的载体，所述载体如：稀释剂、赋形剂（比如水）等，填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶 纤维素等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等，润湿剂如甘油等，表面活性 剂如十六烷醇等，崩解剂如碳酸钙、交聚维酮、羟基乙酸淀粉钠等，润滑剂如滑石粉、硬脂酰 富马酸钠、硬脂酸钙和镁等。
[0049] 可采用本领域公知的方法，将治疗有效量的黑果枸杞果实提取物与一种或多种药 学上可接受的载体相混合，制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、软胶 囊、口服液、注射液、针剂、乳剂（含微乳、亚微乳）、软膏、栓剂、贴剂、巴布剂等，其中活性成 分的含量为〇? 1%~99. 5% (重量比）。
[0050] 本发明可通过口服途径施加于需要治疗的患者，剂量为50_200mg/kg/体重/天；
[0051] 本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0052] 毒性试验证明，所述黑果枸杞果实提取物毒性小鼠口服给药5g/kg ?体重?天未 见明显毒性，即使长期使用，也对人体无害；在申请人此前申请的专利（专利名称：黑果枸 杞果实提取物及制备方法和应用，【申请号】201310274771. 5)基础上，通过动物体内试验， 发现了黑果枸杞果实提取物对干燥综合征有显著疗效，可以用于制备治疗干燥综合征的药 物。
【附图说明】
[0053] 图1?矮牵牛单宁（petanin)对照品液相图谱。
[0054] 图2.黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁含量测定液相图谱。
[0055] 图3.空白溶液液相图谱。
[0056] 图4. AQP5免疫组化染色结果（模型对照组）
[0057] 图5.AQP5免疫组化染色结果（HGGQ组）?
[0058] 图 6.AQP5RT-PCR测定结果
【具体实施方式】
[0059] 实施例1
[0060] 黑果枸杞果实提取物的检测方法
[0061] 黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁（petanin)的含量测定照高效液相色谱法（中 华人民共和国药典附录VID)和我们此前申请的专利（【申请号】201310274771. 5)所公开的 测定方法测定，具体方法为：
[0062] 1 ?仪器和试药
[0063] Waters e2695高效液相色谱仪，配Waters 2998PAD二极管阵列紫外检测器，乙腈 为色谱纯，甲酸为分析纯（97%，Alfa Aesar公司），水为纯净水（娃哈哈公司）。对照品矮 牵牛单宁（petanin)为从黑果枸杞果实提取物中分离制备，其理化数据如下：
[0064] 紫红色粉末，1H-Nmr(CD3(^CF3O)ODAI):矮牵牛花苷元部分 8.89(s，H-4)，6.97(d，J= 1.5Hz，H-6)，6.98 (d，J= 1.5Hz，H-8)，7.89 (d，J= 2. 0Hz,H-2 ' ),1.73 (d,J= 2. 0Hz,H-6 ' )，3. 95 (3H，s，OMe) ;3-〇-P-葡萄糖 部分 5.51(d，J= 7.5Hz，H-l)，3.77(dd，J= 7.5,9.0Hz，H-2)，3.67(t-like，J=9. 0Hz,H-3) , 3. 53 (dd,J= 9. 0, 9. 5Hz,H-4) , 3. 89 (m,H-5) , 4. 04 (dd,J= 11.5,2.0Hz，H-6a)，3.77(dd，J= 11.5,5.8Hz，H-6b);鼠李糖部分 4.71(brs,H-l)，3 .85(brs,H-2), 3. 86(d,J= 9. 5Hz,H-3),4. 89 (t-1ike,J= 9. 5Hz,H-4),3. 78 (dd,J =9.5,6.5Hz，H-5)，1.09(d，J= 6.5Hz,H-6) ;5-0-P-葡萄糖部分 5.18(d,J= 8. 0Hz,H-l),3. 74 (m,H-2),3. 63 (m,H-3),3. 57 (m,H-4),3. 64 (m,H-5),3. 98 (d,J= 12. 0Hz, H-6a),3. 84 (dd, J = 12. 0, 6. 0Hz, H-6b);反式香豆酰部分 7. 38 (2H