一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方 法。
【背景技术】
[0002] 接种疫苗是畜牧业重要的疾病防控手段，尤其在禽类养殖领域，由病原微生物所 导致的多种疾病往往造成严重的经济损失。其中包括鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病 毒、禽流感病毒、鸡减蛋综合症病毒、鸡传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒等在内的治病微 生物均可利用疫苗加以防控。
[0003] 为了获得更好的免疫效果，一方面应当开发更为有效的抗原物质，同时还应当选 择合适的剂型从而提升免疫效力、降低不良反应发生率。油包水型灭活疫苗是目前市场常 用的预防以上家禽疾病的一种疫苗，与活疫苗相比灭活疫苗拥有使用安全、能够有效刺激 机体产生抗体、抗体持续时间长等特点。灭活疫苗领域存在的问题有抗原纯度不高，杂质较 多；灭活疫苗粒度较大，稀释缓慢；免疫原性一般，抗体水平不高；疫苗保存期短等。因此导 致灭活疫苗出现质量参差不齐，疫苗免疫后个体产生抗体水平的整齐度不高，抗体持续水 平长短不一，不能与进口疫苗相媲美等通病。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制 备方法，以解决现有技术的相关疫苗纯度低、杂质高的技术问题。
[0005] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关灭活疫苗粒度大、不易稀释。
[0006] 本发明要解决的再一技术问题是现有技术的相关疫苗免疫效力较差。
[0007] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种禽用纳米级油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)分别培养作为疫苗抗原的病毒；
[0010] 2)收获上述病毒培养液分别进行病毒纯化、浓缩、灭活，混合得到病毒混合液；
[0011] 3)将步骤2)病毒混合液与免疫增强剂混合得到疫苗抗原；
[0012] 4)对步骤3)所得的疫苗抗原先利用胶体磨进行初步乳化，而后进行纳米乳化，SP 得到疫苗成品；
[0013] 其中所述纯化、浓缩，包括以下步骤：
[0014] a)将收获的病毒培养液冻融后，管式尚心机尚心，收集上清；
[0015] b)将所述上清用0. 45um孔径的中空纤维滤柱过滤；
[0016] c)再用0? Ium~0? 22um中空纤维滤柱过滤，而后进行2~5倍体积浓缩。
[0017] 优选的，步骤3)具体包括以下操作：
[0018] m)取病毒混合液总体积10~20%的2%黄芪多糖注射液将P -葡聚糖充分溶解， 0 -葡聚糖终浓度为10~40mg/ml ;
[0019] n)取病毒混合液总体积10~20 %的转移因子溶液将维生素C充分溶解，维生素 C终浓度为10~50mg/ml ;
[0020] p)取步骤m)和步骤n)所得产物与病毒混合液三者混合，按照混合物总体的 4%~5%加入吐温80,即得到疫苗抗原。
[0021] 优选的，步骤4)具体包括以下操作：
[0022] u)取步骤3)所得的疫苗抗原利用胶体磨乳化2~3遍，其中所述疫苗抗原为水 相，水相与油相体积比为1:1. 5~1:3,得到油乳剂疫苗；
[0023] V)将步骤u)所述油乳剂疫苗利用高压均质机在100~200bar工作压力下进行第 一次纳米乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300~400bar工作压力下进行第二次纳米 乳化，而后冷却，再利用高压均质机在300~400bar工作压力下进行第三次纳米乳化，而后 冷却，即得到疫苗成品。
[0024] 优选的，步骤u)中所述油相是通过以下方法制备的：取注射用白油94份，按6% (w/w)和2% (w/w)的比例加入司班-80和硬脂酸错，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解 至透明为止，高压灭菌即得到所述油相。
[0025] 优选的，步骤2)所述灭活包括以下操作：向浓缩后产物中加入甲醛至终浓度 0? 1~0? 2%，37°C灭活16小时。
[0026] 优选的，步骤1)中所述病毒是鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病 毒、鸡减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒或传染性法氏囊病病毒。
[0027] 优选的，步骤u)中所述利用胶体磨乳化包括以下步骤：取配方量的油相加入胶体 磨漏斗中，再加入配方量的疫苗抗原，剪切搅拌10~15分钟。
[0028] 优选的，所述疫苗成品中溶质的粒径为10~100nm。
[0029] 在以上技术方案中，（1)采用多级连续纯化浓缩的方法，使用管式离心机和不同孔 径的中空纤维超滤膜进行不同级别的过滤，截留大分子和小分子杂质，取出纯度较高的抗 原溶液。（2)采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使灭活疫 苗油包水颗粒达到纳米级别，均匀度良好。常规胶体磨循环乳化2~3遍使灭活疫苗达到 常规性状要求，然后通过管道连接高压均质机进液口，在均质机中循环乳化3~4次，达到 IOOnm以下级别，同时均质机连接冷却装置，降低疫苗乳化过程中的温度，保证疫苗的效果。 (3)在水相制备的过成中增加了免疫增强剂，免疫增强剂的成分及含量：2%黄芪多糖注射 液〇? 5份、P -葡聚糖10~40mg/ml、维生素C 10~50mg/ml、转移因子溶液0? 5份，增强 剂按照20~40%的比例加入到病毒液中，通过该免疫增强剂的添加，能够显著提升疫苗免 疫效果。
[0030] 其技术优势主要体现在以下方面：
[0031] (1)本发明制备的灭活疫苗采用多级连续纯化的方法，在最大程度上对抗原进行 纯化，祛除杂质，保证抗原纯净性，提高抗体水平。
[0032] (2)本发明采用胶体磨和均质机连续乳化的方式对灭活疫苗进行纳米级乳化，使 灭活疫苗油包水颗粒达到纳米级别，并且均匀度良好，缩短疫苗注射后抗体产生的时间，提 高抗体均匀度。
[0033] (3)本发明在水相制备的过成中增加了免疫增强剂，有效的诱导机体产生免疫反 应，再次提高抗体水平。
[0034] (4)本发明通过提高抗原纯度、降低疫苗粒度来达到延长疫苗保质期的效果。
【具体实施方式】
[0035] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0036] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约1〇〇"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0037] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0038] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0039] 实施例1
[0040] 一种可预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡传染性法氏囊病、禽 呼肠孤病毒和禽流感病毒纳米级灭活疫苗制备的一种方法，所述疫苗通过包括以下步骤的 疫苗制备方法制备得到：
[0041] 1)通过鸡胚扩大培养鸡新城疫病毒；或（和）通过鸡胚扩大培养鸡传染性支气管 炎病毒；或（和）通过鸡胚扩大培养禽流感病毒；或（和）通过鸭胚扩大培养鸡减蛋综合症 病毒；或（和）通过宿主细胞扩大培养鸡传染性法氏囊病病毒（或禽流感病毒或禽呼肠孤 病毒）；
[0042] 2)分别收获上述病毒扩大培养产物并进行病毒纯化、浓缩；
[0043] 3)分别对上述浓缩产物进行病毒含量测定和病毒灭活处理；
[0044] 4)分别对上述灭活产物进行半成品检验；
[0045] 5)检验合格的半成品与免疫增强剂进行混合制得疫苗抗原；
[0046] 6)疫苗抗原经初乳、纳米乳化后得到疫苗成品；
[0047] 7)疫苗成品经分装检验后即为商品化疫苗。
[0048] 上述禽用纳米级灭活疫苗的病毒纯化、浓缩采用多级连续的方式，其具体纯化、浓 缩过程包括以下步骤：
[0049] 1)将收获的病毒液反复冻融后，管式离心机高速离心去除大颗粒杂质，收集上清 至无菌罐体中；
[0050] 2)取滤液用0. 45um孔对径的中空纤维滤柱，利用管道及蠕动栗对初滤的病毒液 大颗粒物质过滤；
[0051] 3)取0? Ium~0? 22um中空纤维滤柱过滤去掉病