含海藻糖的稳定化因子ix制剂的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2008年12月16日的题为"含海藻糖的稳定化因子IX制剂"的 中国专利申请No. 200880122207. 9的分案申请。
[000引相关申请
[0003] 本发明要求享有于2007年12月21日提交的美国临时申请No. 61/016,230的优 先权，将其结合于本文中作为参考。
[0004] 联合研究协议的各方
[0005]运项工作是作为InspirationBio地armaceuticals,Inc.和IC0SCo巧.之间的 研究协议的结果而产生的。
技术领域
[0006] 本发明的实施方式设及在冻干和储存期间蛋白质结构和活性的稳定化，具体而 言，设及凝血因子如因子IX的稳定化。
【背景技术】
[0007] 因子IX是参与凝血途径的单链糖蛋白。因子IX是一种含有氨基末端信号肤和前 原（prepro)前导序列（二者在分泌进入循环系统之前断裂）W及负责Ca2+结合的Gla结 构域的结构复杂分子（或结构性配分子，structurallycomplexmolecule)。巧结合通过 结合至凝血活性所需的蛋白W及诱导其构象变化而在因子IX功能中发挥重要作用。巧结 合导致之前埋藏的疏水结合位点暴露，运些结合位点有利于结合至有效凝血的憐脂。为了 产生活性蛋白，维持因子IX的巧结合性质是必要的。一旦活化肤被切割，则单链因子IX变 成活化的酶因子IXa，一种经由链间二硫键连接的双链糖蛋白。另外，该分子含有多个N和 0-连接的糖基化位点。因子IX的缺乏导致B型血友病，对该病目前可利用多种疗法，包括 巧烁巧FIX⑧，一种因子IX的重组形式，和Monordne⑥，其来源于人体血浆。
[000引 Mononii'ie饭的制剂由组氨酸、甘露醇、氯化钢和聚山梨醇醋80组成。运些主 要是已知在冷冻期间表现出共晶转变（eutectictransition)(结晶行为）的赋形剂。然 而，Mononine⑩制剂不含防冻剂或稳定剂，仅有缓冲剂、疏松剂（或蓬松剂，buying agent)、等张剂和表面活性剂。因此，在冷冻、冻干和随后的储存期间，该蛋白相对地未进行 物理保护且由于暴露于冰、水和空气而产生变性效应。运里解决的技术问题是一种改良的 因子IX制剂，其中改善了冷冻、冻干和储存期间的稳定性。本发明的发明人已经发现，在冷 冻、冻干和储存期间，在因子IX组合物中包含海藻糖稳定了因子IX的巧结合能力并维持了 运种纯化蛋白的生物活性。
【发明内容】
[0009] 本发明的实施方式设及包含因子IX和海藻糖的冻干组合物。优选地，海藻糖W在 冻干和25°C下储存6个月期间足W保留超过90%的因子IX的巧结合性质的量存在。
[0010] 优选地，海藻糖按体积计W0. 5~3%的量存在。且更优选地，海藻糖按体积计w 1~2%的量存在。
[0011] 在一些优选实施方式中，该组合物包含作为缓冲剂的组氨酸。在一些优选实施方 式中，该组合物包含甘露醇。在一些优选实施方式中，该组合物包含氯化钢。在一些优选实 施方式中，该组合物包含聚山梨醇醋80。
[0012] 在一个最优选的实施方式中，组合物包含因子IX和海藻糖，并另外地包含浓度为 5~20mM的组氨酸、按体积计浓度为2~5%的甘露醇、浓度为50~80mM的氯化钢、和按 体积计浓度为0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋80。
[0013] 本发明的实施方式设及制备因子IX的稳定干燥组合物的方法，该方法通过混合 含有因子IX和海藻糖的溶液W获得一种防冻溶液并冷冻干燥该防冻溶液而获得因子IX的 稳定干燥组合物。优选地，因子IX的干燥组合物在25°C下储存6个月后保留超过90%的 巧结合活性。
[0014] 优选地，海藻糖按体积计W0. 5~3 %的量存在。而更优选地，海藻糖按体积计W 1~2%的量存在。
[0015] 在一些优选实施方式中，所述溶液包含作为缓冲剂的组氨酸。在一些优选实施方 式中，所述溶液包含甘露醇。在一些优选实施方式中，所述溶液包含氯化钢。在一些优选实 施方式中，所述溶液包含聚山梨醇醋80。
[0016] 在一个最优选的实施方式中，所述溶液包含因子IX和海藻糖并另外地包含浓度 为5~20mM的组氨酸、按体积计浓度为2~5%的甘露醇、浓度为50~80mM的氯化钢、和 按体积计浓度为0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋80。
[0017] 优选地，冷冻干燥操作包括一个退火步骤。
[0018] 本发明的实施方式设及通过包括W下步骤中的一个或多个的方法冻干包含因子 IX和海藻糖的药物制剂的方法：
[0019] (a)在-40°c或更低的溫度下冷冻包含因子IX和海藻糖的药物制剂；
[0020] 化）在约-20°C和-35°C之间退火该药物制剂；
[0021](C)将该药物制剂的溫度降低至-40°C或更低；
[0022] (d)在5°C~20°C于减压下在第一干燥步骤中干燥该药物制剂；和
[0023] (e)在45°C~55°C于减压下在第二干燥步骤中干燥该药物制剂。
[0024] 优选地，该药物制剂还包含浓度为5~20mM的组氨酸、按体积计浓度为2~5% 的甘露醇、浓度为50~80mM的氯化钢、和按体积计浓度为0. 001~0. 005%的聚山梨醇醋 80 〇
[0025] 根据W下对优选实施方式的详细描述，本发明的其他方面、特征和优点将会显而 易见。
【附图说明】
[0026] 现在将参照优选实施方式的附图，描述本发明的运些和其他特征，运些优选实施 方式用于举例说明本发明而非限制本发明。
[0027] 图1示出了因子IX在40°C/75%RH下的稳定性。""表示在lOmM组氨酸、3%甘 露醇、66mMNaCl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白巧l)。"?" 表示在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化Cl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 % 海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0028] 图2A和2B示出了在储存12周之后因子IX组合物的SE-HPLC洗脱曲线图。图 2A示出了在10mM组氨酸、3%甘露醇、66mM化Cl和 0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的 0. 4mg/mL因子IX蛋白on)。图2B示出了在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0. 0075% 聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0029] 图3A和3B示出了在储存12周之后因子IX的SE-HPLC(巧）洗脱曲线图。图3A 示出了在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化C1和0. 0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中的 0. 4mg/mL因子IX蛋白on)。图3B示出了在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0. 0075% 聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0030] 图4示出了在40°C775%RH下因子IX巧结合稳定性。""表示在lOmM组氨酸、 3%甘露醇、66mM化Cl、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白an)。 "?"表示在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化C1、0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具 有1%海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
[0031] 图5示出了在非还原（A)和还原做条件下储存12周之后，因子IX制剂 的SDS-PAGE分析。图5中图A:泳道1，空白；泳道2,标记物；泳道3,因子IX参考标 准（Mononme風）；泳道 4,0. 4mg/ml，R1，冻干（lyo)-20°C;泳道 5,0. 4mg/ml，R2,冻 干-20°C;泳道 6,0. 4mg/ml，R1，冻干 2 ~8°C;泳道 7,0. 4mg/ml，R2,冻干 2 ~8°C;泳道 8， 0. 4mg/ml，R1，冻干 25°C;泳道 9,0. 4mg/mL，R2,冻干 25°C;泳道 10,0. 4mg/mL，R1，冻干 40°C; 泳道11,0. 4mg/ml，R2,冻干40°C;泳道12,标记物。图5中图B:泳道1和2,标记物；泳道 3,因子IX参考标准（Mononine够）；泳道 4,0. 4mg/ml，R1，冻干-20°C;泳道 5,0. 4mg/ml， R2,冻干-20°C;泳道 6,0. 4mg/mL，R1，冻干 2 ~8°C;泳道 7,0. 4mg/mL，R2,冻干 2 ~8°C; 泳道 8,0. 4mg/mL，R1，冻干 25°C;泳道 9,0. 4mg/mL，R2,冻干 25°C;泳道 10,0. 4mg/ml，R1， 冻干40°C;泳道11,0. 4mg/ml，R2,冻干40°C;泳道12,标记物。
[0032] 图6示出了因子IX组合物在储存12周之后的阴离子交换HPLC洗脱曲线图。图6 中A图示出了在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化C1和0.0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中 的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧1)。图6中B图示出了在lOmM组氨酸、3%甘露醇、66mM化CI、 0. 0075%聚山梨醇醋80(pH6. 8)中并具有1 %海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白巧2)。
【具体实施方式】
[0033] 尽管所描述的实施方式代表了本发明的优选实施方式，但是应该理解，对于本领 域技术人员而言可W进行变形而不会偏离本发明的精神。因此本发明的范围将仅仅由所附 权利要求进行确定。
[0034] 本发明的实施方式设及在海藻糖存在下冻干因子IX的方法W及含海藻糖的因子 IX制剂。在添加和没有添加海藻糖的情况下对因子IX制剂进行评价，其中海藻糖是一种在 冻干工艺期间不会结晶的防冻剂。随着冷冻至较低溫度，海藻糖保持为一种经历玻璃转化 的浓缩物。因此，在海藻糖存在下，蛋白得W保存，通过冷冻和冻干而保持混合无定形状态 并被稳定化。海藻糖改善了储存的因子IX蛋白的稳定