牛蒡根寡糖在制备抗血栓药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛蒡根寡糖的用途，尤其是一种牛蒡根寡糖在制备抗血栓药物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 血栓栓塞性疾病（thromboembolicdisease)目前已是严重危害人类健康的多发 病，可分为静脉血栓和动脉血栓。动脉血栓大多是因为血管内皮细胞受损，血小板粘附以及 聚集而导致；而静脉血栓一般是由于血液流动缓慢或者瘀滞而引起。牛蒡（ArctiumLappa L.)系菊科两年生草本植物，牛蒡根含有多种活性成分，如多酚类，醛类，多炔类，多种氨基 酸以及糖等。近年来已有从牛蒡根中提取牛蒡根多糖和寡糖的相关报道，研究表明牛蒡多 糖能够调节机体免疫力，并且在抗肿瘤、抗肝炎、降血脂、抗衰老方面等方面有独特的生理 功能。但是，迄今为止还没有关于牛蒡根寡糖在抗血栓方面应用的相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明是发现了牛蒡根寡糖具有抗血栓的作用，进而发明了蒡根寡糖在制备抗血 栓药物中的应用。
[0004] 本发明的技术解决方案是：一种牛蒡根寡糖在制备抗血栓药物中的应用。
[0005] 具体是在制备抑制血小板聚集药物中的应用。
[0006] 具体是在制备保护血管内皮细胞药物中的应用。
[0007] 本发明的牛蒡根寡糖提取成本低、毒副作用小，具有抑制血小板聚集、保护血管内 皮细胞及抗血栓的作用，可应用于制备抗血栓药物。
【附图说明】
[0008] 图1是本发明实施例牛蒡根寡糖水提取物S印hadexG-50洗脱图。
[0009] 图2是本发明实施例HPGPC法高效液相色谱仪检测牛蒡根寡糖色谱图。
[0010] 图3是本发明牛蒡根寡糖各实验组各时刻点下的血小板聚集率效果图。
[0011] 图4是本发明牛蒡根寡糖对rhTNF-a损伤HY926细胞的N0水平的影响示意图。
[0012] 图5是本发明牛蒡根寡糖对角叉菜胶所致小鼠尾动脉血栓形成平均相对长度的 作用示意图。
[0013] 图6本发明牛蒡根寡糖对FeC13诱导的大鼠颈总动脉血栓形成的影响示意图。
[0014] 图7本发明牛蒡根寡糖对ADP诱导的大鼠血小板聚集率的影响示意图。
[0015] 图8本发明牛蒡根寡糖对大鼠血浆中AT-III含量的影响示意图。
【具体实施方式】
[0016] 牛蒡根寡糖的制备： 提取方法如下： 1) 将牛蒡根洗净切片，置于60°C烘箱内干燥12h以上，机械粉碎，制得干粉； 2) 称取步骤1)所得牛蒡根干粉20g置于250ml圆底烧瓶内，量取100ml(4~5倍体积） 80%乙醇（乙醇：蒸馏水=4:1 )，60°C回流提取6h，弃去提取液以除去单糖、双糖、苷元等醇溶 性杂质，将溶剂挥干得干粉； 3) 量取4~5倍体积（100ml)石油醚倒入装有步骤2)所得牛蒡根干粉的烧瓶中，45°C 回流提取1. 5h后将溶液挥干，制得干粉； 4) 将步骤3)所得干粉倒入1000ml烧瓶内，量取300ml(15倍）蒸馏水加入烧瓶中， 95°C水浴加热3h，反复提取四次，合并滤液浓缩至适量体积，得到牛蒡根寡糖浓缩液； 5) 向步骤4)所得浓缩液中加入1/5体积的Savage试剂(氯仿：正丁醇=4:1)，振摇 lOmin，离心（3600r?min-1，15min)，取上清液，反复4~5次，以充分除去蛋白，得到富含牛蒡 根寡糖的上层水溶液； 6 )向步骤5 )所得上清液中加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜（> 12h)，离心（5000r?min-1，15min)，弃上清，将沉淀用45°C水溶解，反复醇沉水提4~5次，使牛蒡根寡糖充分 沉淀；将沉淀分别用无水乙醇和丙酮各洗涤3次，挥干溶剂，冷冻干燥，即得脱脂脱蛋白的 牛蒡根寡糖干粉，备用； 7)将前面所得的牛蒡根水提取物干粉通过硫酸一苯酚法测定其寡糖含量，牛蒡根水提 取物干粉的寡糖含量为70%。
[0017] 所得的牛蒡根水提取物的纯化方法如下： 1) 将新买的葡聚糖凝胶G5(]20g用蒸馏水漂洗3~5次，将浮在上层的凝胶颗粒弃 去，再经过沸水浴1h，使其充分溶胀且起到杀菌消毒的作用，然后将凝胶装入层析柱 (小2. 0cm*60cm)中，再用2~3体积的水使柱床稳定； 2) 将制得的精制牛蒡根多糖提取物粉末用蒸馏水以适当溶解度比例溶解（0. 5g干粉 用5ml蒸馏水溶解)，将制得的药物水溶液经过葡聚糖凝胶柱层析； 3) 葡聚糖凝胶层析条件为：以水为洗脱液，室温条件（25°C)，流速为1.Oml/min~ 2.Oml/min，自动部分收集洗脱液，每2ml-管； 4) 用硫酸一苯酚法逐管检测，通过酶标仪在492nm波长处测定吸光值，根据洗脱体积 (或收集的管数）与吸光度值做图，得到对应的洗脱图(见附图1 )，根据得到的洗脱图中的洗 脱峰合并洗脱液，减压浓缩，得到了牛蒡根寡糖初纯产物； 5) 将浓缩液按1)~4)再次纯化，浓缩，收集。
[0018] 将按上述方法提取纯化所得的牛蒡根寡糖干粉通过HPGPC法测定纯度及分子量， 通过核磁共振氢谱检测其化学结构。
[0019] HPGPC法测定纯度及分子量： 1) 将样品用三蒸水配成1. 5mg/ml溶液； 2)Waters1525 高效液相色谱仪（ShodexOhpakSB-803HQ，8.0mmI.D.X300mm， Waters2410示差折光检测器）检测，其检测条件为：柱温为30°C，流动相为三蒸水，进样量 为20yl，流速为0.8ml/min。得到高效液相色谱图(见附图2); 3) 根据主峰峰形和不同保留时间下峰面积比计算样品纯度。采用HPGPC法，一标准 DextranT系列葡聚糖为标准品，计算Mw。根据HPLC图谱可知，该提取物为纯度可达到 97. 7%的牛蒡根寡糖，Mw为213?a。
[0020] 所制备的牛蒡根寡糖为以下实验材料。
[0021] 实验： 实验例1牛蒡根寡糖对体外ADP诱导的血小板聚集的抑制作用 1. 1实验材料 新西兰大白兔，雄性，体重1. 5~2kg，由大连医科大学动物中心提供。
[0022] ADP粉末由上海普利生公司提供。
[0023] 1. 2实验方法 1. 2. 1实验分组 模型组：ADP诱导的血小板聚集模型组，不加药。
[0024] 实验组：分三个给药剂量的实验组，分别加入不同浓度的药品；再加入与模型组 相同体积的ADP溶液。
[0025] 1. 2. 2实验方法 新西兰大白兔心脏左心室取得动脉血，用3. 8%枸橼酸钠与血按1:9的比例抗凝，迅 速将取得血与抗凝剂轻轻的混匀，避免剧烈震以防止溶血。将抗凝血放入水平离心机内 先以800rmp的转速离心5min，收集上层乳白色的血衆即为富血小板血衆（plateletrich plasma，PRP)，将下层血细胞部分再经过2000rmp离心5min，取上层淡黄色血衆部分得到 贫血小板血衆（plateletpoorplasma，PPP)。采用比池法进行血小板聚集性测定，利用 LBY-NJ2型四通道血小板聚集仪描记血小板聚集曲线，记录5min内血小板最大聚集率。
[0026] 1. 3实验结果 终浓度为7. 5yg/ml的ADP作用于PRP300S，分别得到60s、180s、300s和最大血小板聚 集率(max)，根据时间点的值可得到一个药物改变血小板聚集的时间抑制率图（见附图3 )， 各组平均最大聚集率见下表1。
[0027] 表1牛蒡根水提取物对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用（x土semn=10) 汪：衣不谷纽与损仂纽?比彡U.Ub。
[0028] 实验例2牛蒡根寡糖对人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用 在血管内皮细胞中，静息状态下，内皮细胞中的eNOS催化产生产生低浓度的N0,发挥 生理性调节作用，保护内皮细胞以维持内皮的完整性