一种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法。
【背景技术】
[0002]笑话^Notopterygiumincisum Ting ex H.T Chang)为伞形科(Umbelliferae)宪活属(Notopterygium)植物的干燥根及支根，主要分布于四川、云南、青海及甘肃等地。现代研究表明羌活中化学成分主要包括单萜类、倍半萜类、苯丙素类、香豆素类、氨基酸类、有机酸及有机酸酯类，其中香豆素类化合物以其显著的抗肿瘤活性被人熟知。
[0003]目前，中国专利(102367256A)报道采用超临界二氧化碳萃取法提取、结晶两步获得羌活异欧前胡素提取物，然而从羌活中规模化制备抗结肠癌浸膏粉的研究未见文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化实施、重复性较好、质量稳定可控的抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的一种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法，包括以下步骤:
⑴提取:将羌活药材粉碎至60~120目后，加入体积分数为95%的乙醇溶液或甲醇溶液进行醇提，经过滤得到滤液；该滤液经减压干燥至膏状，即得羌活醇提物；
⑵液液分配富集:所述羌活醇提物用其质量30~50倍的分析纯水分散，得到分散液；该分散液用其30~50倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液经减压干燥得羌活乙酸乙酯部位；
⑶树脂柱色谱除杂:在所述羌活乙酸乙酯部位中加入其质量2~5倍的体积分数为5-20%的甲醇溶液进行溶解，然后经树脂柱分离，并依次以水溶液、体积分数为90%的甲醇溶液按2~5倍的柱体积进行梯度洗脱，收集90%甲醇洗脱物；该90%甲醇洗脱物经减压干燥即得羌活浸膏粗粉；
⑷硅胶柱层析分离:在所述羌活浸膏粗粉中加入其质量2~5倍体积分数为80~100%的甲醇溶液进行溶解，经硅胶柱色谱分离后，用5~10倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按每份500~1000 mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液，合并Rf值为0.1-0.8的馏分；所述Rf值为0.1-0.8的馏分经减压干燥，即得呈黄色粉末状的羌活浸膏粉。
[0006]所述步骤⑴中醇提条件是指料液比为Ikg:10~20L、温度为60°C ~95°C、提取次数为1~3次、每次提取时间为1~3 ho
[0007]所述步骤⑴、所述步骤⑵、所述步骤⑶及所述步骤⑷中的减压干燥条件均是指真空度为 0.06-0.09 MPa,温度为 50-65 °C。
[0008]所述步骤⑶中树脂柱为HP20型树脂柱、HP20SS型树脂柱或MCI型树脂柱中的一种。
[0009]所述步骤⑷中氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按8:2~2:8的体积比混合而成的溶剂。
[0010]所述步骤⑷中娃胶柱的尺寸为30 mm~60 mmX60 mm -100 mm。
[0011]如上所述的一种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法制得的羌活浸膏粉在制备抗结肠癌药物或保健食品中的应用，其特征在于:该羌活浸膏粉作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗结肠癌药用制剂，或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
[0012]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用95%乙醇溶液或甲醇溶液提取，溶解可以回收利用，平均成本廉价，且易规模化实施。
[0013]2、本发明采用液液分配法富集羌活中乙酸乙酯部位，溶剂价格低廉，且可以再生循环使用，易于规模化。
[0014]3、本发明树脂柱可以再生循环使用，同时树脂有脱色的功效，且回收率较高。
[0015]4、本发明采用硅胶柱层析分离，可直接将羌活中挥发性类组分与目标化合物分开，同时去除部分强极性杂质。
[0016]5、本发明原料要求不高，一般市场上或野生原材料即可，易于批量备料。
[0017]6、本发明工艺简单、重复性较好、质量稳定可控，所得到的羌活浸膏粉经二维制备色谱分离纯化及NMR氢谱、碳谱分析，依次判定主要含有异欧前胡素、佛手柑内酯及其他香豆素类化合物。
[0018]7、本发明所获得的羌活浸膏粉经测试，具有很好的抗结肠癌的作用。
[0019]⑴实验方法采用国际通用的MTT测定方法进行:首先，在96孔细胞板上接种2X 14个对数生长期的结肠癌细胞HCT116，3个复孔，细胞贴壁后；再加入不同浓度待测样品，共设置7个药物浓度梯度，分别为:1.0 yg/mL、5.0 yg/mL、10.0 yg/mL、20 yg/mL、30 μ g/mL、40 μ g/mL和50 μ g/mL的该羌活浸膏粉样品组；72小时后，于96孔板对应孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，继续培养3 h ;弃去96孔板中上清液，加入100 μ L DMSO溶解，使用酶标仪检测570 nm波长下的吸光值并计算待测样品对结肠癌细胞生长的半数抑制浓度IC500
[0020]⑵实验结果表明，实施例1~3组羌活浸膏粉对结肠癌细胞株均有明显的抑制作用，依次为 39.6 μ g/mL,38.9 μ g/mL,39.3 μ g/mL，平均值为 39.3 μ g/mL。
【具体实施方式】
[0021]实施例1 一种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法，包括以下步骤:
⑴提取:将5.0 Kg羌活药材粉碎至60目后，加入体积分数为95%的乙醇溶液或甲醇溶液进行醇提，经过滤得到滤液；该滤液在真空度为0.06 MPa、温度为65°C的条件下经减压干燥至膏状，即得羌活醇提物984.6 go
[0022]其中:醇提条件是指料液比为Ikg:10L、温度为95°C、提取次数为3次、每次提取时间为I h。
[0023]⑵液液分配富集:羌活醇提物用其质量30倍的分析纯水分散，得到分散液；该分散液用其30倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液在真空度为0.06 MPa、温度为65°C的条件下经减压干燥得羌活乙酸乙酯部位378.1 g。
[0024]⑶树脂柱色谱除杂:在羌活乙酸乙酯部位中加入其质量2倍的体积分数为20%的甲醇溶液进行溶解，然后经树脂柱分离，并依次以水溶液、体积分数为90%的甲醇溶液按2倍的柱体积进行梯度洗脱，收集90%甲醇洗脱物；该90%甲醇洗脱物在真空度为0.06 MPa、温度为65°C的条件下经减压干燥即得羌活浸膏粗粉328.6 go
[0025]其中:树脂柱为HP20型树脂柱。羌活乙酸乙酯部位与树脂比例为I g:30 mL。
[0026]⑷硅胶柱层析分离:在羌活浸膏粗粉中加入其质量5倍体积分数为80%的甲醇溶液进行溶解，经硅胶柱色谱分离后，用5倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，按每份500mL收集馏分，并经薄层色谱检测，其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比(mL/ mL)混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液，合并Rf值为0.1-0.8的馏分；Rf值为0.1-0.8的馏分在真空度为0.06 MPa、温度为65°C的条件下经减压干燥，即得呈黄色粉末状的羌活浸膏粉227.4 go
[0027]其中:氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按2:8的体积比(mL/ mL)混合而成的溶剂。
[0028]娃胶柱的尺寸为30 mmX60 mm。
[0029]实施例2 —种抗结肠癌羌活浸膏粉的规模化制备方法，包括以下步骤:
⑴提取:将10.0 Kg羌活药材粉碎至120目后，加入体积分数为95%的乙醇溶液或甲醇溶液进行醇提，经过滤得到滤液；该滤液在真空度为0.09 MPa、温度为50°C的条件下经减压干燥至