一种可注射的镶嵌含BMP-2和TGF-β1微粒的PLGA多孔复合微球制剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及一种可注射的镶嵌含ΒΜΡ-2和TGF-β I微粒的PLGA多孔复合微球制剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]日常生活中较常出现骨和软骨损伤，其临床治疗效果不佳，常规手术治疗往往给患者带来持续的疼痛，易导致骨不连等副作用的发生。利用骨组织工程学，采用可降解聚合物材料制成组织工程支架以修复骨和软骨损伤是近年来的研究热点。组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与技术，研究用于修复、维护和促进人体组织或器官损伤后的形态和功能的生物替代物的学科。随着骨科无创伤和微创等非手术治疗方式的需要，研制兼具可注射、持续释放生长因子、三维多孔结构的细胞支架成为骨和软骨组织工程发展的重要方向之一。
[0003]根据支架植入机体的方式，固体型组织工程支架主要可分为两大类:①可注射型，以微球体为主，既具有一定的力学强度，又具有良好的可流动性，包括两种=(A)载生长因子或化学药物的聚合物微球(没有多孔结构)，能很好地控制药物释放，但没有多孔结构不利于种子细胞在支架上的黏附，也不能提供细胞生长所需的3D空间；(B)多孔微球，能增大微球的表面积以利于细胞附着，并提供细胞在体外生物反应器或体内增殖分化的3D空间，但是不含或无法控释生长因子或化学药物；②非注射型，即需通过手术植入的支架，预先或使用前整合了生长因子或化学药物的多孔支架(或纳米纤维状支架)，形状多为薄膜状、片状、块状等，由于体积较大且有一定刚性，必须通过手术才能植入。
[0004]聚乳酸轻基乙酸(Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由于具有良好的组织相容性和生物可降解性而广泛用于组织工程支架。多孔微球由于既可以注射，又具有一定的力学强度，3D多孔结构还可以作为细胞扩增载体，是一种优良的注射型组织工程支架。但是，多孔结构又会导致生长因子或化学药物的快速释放，这一矛盾需要解决。例如:中国专利申请CN200810044593.6，发明名称为“一种可降解聚合物多孔微球的制备方法及其用途”，公开号为CN101249077，公开了一种可降解聚合物多孔微球的制备方法，制备得到的多孔微球采用吸附法使药物进入微球的多孔结构，但缺点在于吸附的药物释放快速。又如:中国专利CN200810161673.X，发明名称为“ 一种亲水性药物双重微球制剂及其制备方法”，公开号为CN101366700，公开了一种亲水性药物双重微球制剂的制备方法，是先制备亲水性药物的壳聚糖纳米粒，再将制备得到的纳米粒分散至PLGA的乙腈或二氯甲烷溶液中，制得双重微球制剂，该双重微球制剂是将含药壳聚糖纳米粒分散在PLGA微球内部，优点是保持了壳聚糖纳米粒对亲水性药物具有的高包封效率，体外释放缓慢，达到了药物缓释的目的，缺点在于该微球无3D多孔结构，不利于种子细胞黏附和增殖。
[0005]在骨组织工程支架中应用较多的细胞因子是骨形态发生蛋白-2(Bonemorphogenetic protein-2, BMP-2),属于转化生长因子超家族的一员，能够促进间充质干细胞向成骨细胞分化，并导致钙沉积，从而形成新生骨。BMP-2已经广泛用于科研和临床方面的骨组织再生。但是，即使将BMP-2混合在组织工程支架中，需要的BMP-2含量仍然较大，费用高昂，增加了临床转化的难度。转化生长因子_β I (Transforming growthfactor-β I)也是转化生长因子超家族的重要一员，具有促进细胞增殖和分化等作用。
[0006]本申请人已于2013年9月17日，申请了两项中国专利，一是申请号为CN201310425057.1，发明名称为“一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法”，公开号为:CN103495205A ;另一是申请号为CN201310423354.2，发明名称为“一种可注射的镶嵌BMP2微粒的多孔PLGA复合微球制剂及其制备方法与应用”。
[0007]申请人发现目前尚无文献报道一种既具有3D多孔结构有利于种子细胞附着和生长，又可同时缓释控释BMP-2和TGF- β 1，并可用于注射的多孔微球制剂。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种既具有3D多孔结构利于种子细胞附着和生长、又可缓释控释骨形态发生蛋白_2 (Bone morphogenetic protein-2, BMP-2)和转化生长因子-β I (Transforming growth factor-β I, TGF-β I),并可用于注射的，内部镶嵌含BMP-2和TGF-β I微粒的PLGA多孔复合微球制剂。
[0009]本发明的另一个目的是提供该多孔复合微球制剂的制备方法。
[0010]本发明的第三个目的是提供该多孔复合微球制剂在制备骨或软骨组织缺损修复材料中的应用。
[0011 ] 本申请人发现在使用ΒΜΡ-2的同时，合并使用TGF- β I对ΒΜΡ-2有促进作用，从而降低ΒΜΡ-2在支架中的加入量，不仅降低经济成本并可提高疗效。
[0012]本发明的主要技术方案是提供一种可注射的镶嵌含骨形态发生蛋白(Bonemorphogenetic protein-2, BMP-2)和壳聚糖微球和转化生长因子-β I (Transforminggrowth factor-β I,TGF-β I)微粒的聚乳酸轻基乙酸(Poly (lactic-co-glycolic acid),PLGA)多孔复合微球制剂，具体是:
[0013]首先在壳聚糖、明胶、海藻酸钠或白蛋白等亲水性材料中摸索出适合包裹BMP-2和TGF-β I形成含药微粒的材料；
[0014]其次是用于制备多孔微球的材料PLGA，在分子量为5000?300000中摸索优选的分子量;
[0015]再次是初步设定含ΒΜΡ-2微粒和含TGF- β I微粒的重量百分比为1:1至5:1寻找出最合适的配比；
[0016]最后通过体外释放实验、裸鼠皮下异位成骨实验来考察含ΒΜΡ-2和TGF-β I微粒的多孔复合微球制剂是否能促进骨组织修复。
[0017]本发明的第一方面，是提供一种可注射的镶嵌含ΒΜΡ-2和TGF- β I微粒的PLGA多孔复合微球制剂，由多孔微球和镶嵌在多孔微球中的含药微粒组成；所述的多孔微球的平均粒径为为100?500 μ m,平均孔径为20?30 μ m ;所述的含药微粒的平均粒径为200nm?30 μ m ；
[0018]所述的含药微粒为分别独立的含BMP-2微粒和含TGF- β I微粒，所含的药物ΒΜΡ-2或TGF- β I分别占含药微粒的0.01?10% (W/W)，且含ΒΜΡ-2微粒和含TGF- β I微粒的重量百分比为5:1;
[0019]所述的含药微粒，用于含药微粒制备的材料为分子量为100000的壳聚糖，壳聚糖的用量占含药微粒重量百分比为90?99.99% (W/W)；
[0020]所述的含药微粒(含BMP-2微粒和含TGF- β I微粒的总和)占多孔复合微球制剂总体组成(多孔微球+含药微粒)的2?50% (W/W)。
[0021]所述的多孔微球，具有为种子细胞增殖提供模拟体内生长所需的3D空间，用于制备多孔微球的材料为聚乳酸轻基乙酸(Poly (lactic-co-glycolic acid),PLGA),并且采用致孔剂形成孔洞，致孔剂和制备多孔微球的材料的重量比为1:10?1:1 (W/W)。
[0022]所述的多孔微球占多孔复合微球制剂总体组成(多孔微球+含药微粒)的50?98% (W/W) ο
[0023]PLGA分子量的优选方案为100000。
[0024]所述的致孔剂，包括碳酸氢盐、碳酸盐、双氧水、白蛋白和环糊精等，碳酸氢盐包括碳酸氢铵和碳酸氢钠等，碳酸盐包括碳酸锌和碳酸镁等，可选用其中的一种或多种，用量与多孔微球材料比例为1:10?1:1 (W/W)。较佳地，致孔剂可选用碳酸氢铵，和制备多孔微球的材料的重量比为1:4?1:1 (W/W)。
[0025]本发明在壳聚糖、明胶、海藻酸钠和白蛋白等亲水性材料中摸索出分子量为100000的壳聚糖。根据文献报道和初步探索的结果显示，明胶和海藻酸钠制备得到的微球粒径偏大，不利于将其嵌入多孔微球。白蛋白微粒制备条件不利于保持BMP-2和TGF-β I的生物活性。而壳聚糖可以制备得到小粒径的微粒，并具有温和的制备条件。壳聚糖分子量选取100000，分子量过小可导致药物释放加快，分子量过大导致壳聚糖溶液粘度大，不利于制备。
[0026]本发明对制备多孔微球的材料分子量为5000?300000PLGA进行筛选，优选PLGA分子量为100000，利于形成多孔微球并保持了适宜的体内降解时间。小分子量的PLGA无法形成所需孔径和粒径的多孔微球，并且体内降解时间过快，不利于骨组织工程支架的应用。大分子量的PLGA降解时间延长，不利于新生骨组织的形成。
[0027]本发明在含ΒΜΡ-2微粒和含TGF-β I微粒的重量百分比为1:1至5:1中寻找出最合适的配比是5:1，该比例由生长因子包封率和文献报道的生长因子起效浓度确定。在该比例时，ΒΜΡ-2和TGF-β I的含量适宜细胞的增殖分化和新生骨组织的形成。
[0028]进一步地，本发明的一种可注射的镶嵌含ΒΜΡ-2和TGF- β I微粒的PLGA多孔复合微球制剂，可采用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽对多孔微球材料进行修饰，以增加这类材料的亲水性和细胞黏附性，如RGD肽修饰的PLGA衍生物。RGD肽可选用包括含有RGD片段的环肽或线型肽。
[0029]本发明在多孔微球的内部镶嵌含药微粒，具有双重作用:1.)避免BMP-2和TGF-β I突释，降低突释可以减轻药物的全身毒副作用；2.)可缓控释放ΒΜΡ-2和TGF-β 1，以提高局部组织修复疗效。
[0030]本发明同时使用两种生长因子，即ΒΜΡ-2和TG