呼吸道合胞病毒f蛋白表位的利记博彩app
【专利说明】呼吸道合胞病毒F蛋白表位 对以电子方式提交的序列表的引用
[0001] 将与本申请一起以电子方式提交的处于ASCII文本文件形式的序列表的内容（名 称：序列表_ascii.txt;大小：31. 3千字节；以及创建日期2013年3月14日）通过引用以 其全文结合在此。 背景
[0002] 呼吸道合胞病毒（RSV)是属于副粘病毒家族的常见感冒病毒。RSV是具剧毒的， 易传播，并且在小于2岁龄的儿童中是下呼吸道疾病的最常见病因。在单个RSV季节，高达 98%的参加日托的儿童会被感染。感染有RSV的0.5%和3. 2%之间的儿童需要住院。在 美国每年报道大约有90, 000例入院以及4500例死亡。归因于RSV而住院的主要风险因素 是早产、慢性肺病、先天性心脏病、免疫功能受损、以及在其他健康儿童中年龄小于6周。除 以充足营养形式进行的支持疗法和氧疗法外没有可供使用的针对RSV阳性细支气管炎的 有效处理。抗病毒疗法例如利巴韦林未被证明在RSV感染中有效。针对RSV预防目前没有 可供使用的疫苗。
[0003] 现今唯一可用的RSV特异性治疗是一种人源化单克隆抗体帕利珠单抗（也称为 SYNAGIS?)，其通过美国食品及药物管理局批准用于在高危婴儿中预防RSV下呼吸道疾 病。然而，帕利珠单抗不总是有效的。另一种单克隆抗体，莫他珠单抗（在此还称为"莫他 (mota) "），衍生自具有增强的抗病毒活性的帕利珠单抗。帕利珠单抗和莫他珠单抗两者都 结合抗原部位A，即氨基酸258和275之间的RSV-F蛋白上的高度保守区域。已知最好的抗 F抗体（包括帕利珠单抗和莫他珠单抗）识别两个构象（其中RSV-F可以折叠）共享的表 位，即亚稳定的融合前形式和高度稳定融合后构象。
[0004] 本披露提供了融合前构象的RSV-F蛋白上的构象表位，由最近鉴定的抗RSV单克 隆抗体D25(披露于W0 2008/147196中）识别。通过靶向融合前RSV-F结构（针对抑制 RSV-F介导的融合的活性靶标），本披露还提供了用于筛选更有效的较不易受非生产结合 事件影响的抗RSV抗体的方法，因此可以提供对RSV感染的更好预防或治疗。 简要概述
[0005] 在此提供的是呼吸道合胞病毒融合（RSVF)蛋白表面上的构象表位，其中该表位 包括在SEQIDN0:7的氨基酸1至34或SEQIDN0:9的氨基酸1至34中的至少个6氨基 酸，其中包括该表位的RSVF蛋白可以被单克隆抗体D25或其抗原结合片段、变体、类似物 或衍生物特异性结合，条件是该RSVF蛋白处于融合前构象。
[0006] 在一个方面，包括该表位的处于融合前构象的RSVF蛋白可以被亲和力比如下RSV F蛋白大至少100倍的单克隆抗体D25、或其片段、变体、类似物、或衍生物结合，所述RSVF 蛋白包括衍生自单克隆抗体抗性突变体（MARM)的F蛋白的氨基酸序列，其中来自这些该 獻冊的？蛋白包括5￡〇10勵：12、5￡〇10勵：13、或5￡〇10勵：14的氨基酸序列。该表位 可能出现在人RSV亚型AF蛋白的表面上，并且还出现在人RSV亚型BF蛋白的表面上。
[0007] 在某些方面，已知破坏RSVF蛋白的融合前构象的不同处理（例如，加热、长期存 储，固定、或变性）改变或破坏mAbD25与在此提供的构象表位的结合。
[0008] 在此提供的构象表位位于F蛋白七残基重复序列的C-端。
[0009] 进一步提供的是包括上述构象表位的，特异性结合至mAbD25或其抗原结合片段、 变体、类似物、或衍生物的分离的抗原-抗体结构。在某些方面，该结构是晶体结构。
[0010] 进一步提供的是分离的融合蛋白，其包含基本上由SEQ ID N0:7的氨基酸1至34 或SEQ ID N0:9的氨基酸1至34组成的RSV F蛋白片段；以及多肽骨架，其中该骨架将该F 蛋白片段约束在如下构象内，该构象可以由单克隆抗体D25或其抗原结合片段、变体、类似 物、或衍生物特异性结合。在某些方面，该骨架衍生自表面暴露的外壳蛋白，例如蛋白酶抑 制剂，例如南瓜家族蛋白酶抑制剂。在某些具体实施例中，该骨架是来源于喷瓜（Ecballium elaterium)胰蛋白酶抑制剂II(EETI-II)。在某些方面，EETI-II的抑制剂环被SEQ ID NO:7的氨基酸1至34或SEQ ID NO:9的氨基酸1至34替代。在某些方面，该融合蛋白包 含SEQ ID N0:5的序列。
[0011] 进一步提供的是编码在此提供的融合蛋白的分离的多核苷酸、包括该多核苷酸的 表达载体和/或包括该多核苷酸或该载体的宿主细胞。
[0012] 在某些方面，在此提供的融合蛋白可以是包括该融合蛋白以及载体、赋形剂、和/ 或佐剂的免疫原性组合物的部分。
[0013] 在一个另外的方面，在此提供的融合蛋白可以用在用于鉴定抗RSV F蛋白抗体的 方法中，这些抗RSV F蛋白抗体结合至在此提供的构象表位，其中该方法包括针对结合至权 利要求9至15中任一项所述的融合蛋白但不单独结合至该骨架的抗体来筛选抗体文库。 附图/图简要说明
[0014] 图1显示D25单克隆抗体与感染有RSV A2病毒（ATCC VR-1540)的未固定的和丙 酮固定ffip-2细胞的结合，与帕利珠单抗、莫他珠单抗和R347 (作为阴性对照）的结合进行 比较。
[0015] 图2显示Eu3+-标记的莫他珠单抗（"莫他"）和D25与从头或热处理的RSV-F蛋 白的结合。被RSV A2 F蛋白稳定转染的293个细胞被保持在冰上或在水浴中在55°C处理 15分钟。
[0016]图 3 显不生物膜层干涉技术分析（Biolayer Interferometry Analysis)(图 3A) 以测试莫他珠单抗（"莫他"）和D25与从头或热处理的RSV-F蛋白的结合（图3B)。R347 用作阴性对照。
[0017] 图4显示在4°C储存之后D25与RSV-F蛋白的结合的缓慢损失，与在相同条件下莫 他珠单抗（"莫他"）与RSV-F蛋白的结合进行比较，如通过生物膜层干涉技术分析的。
[0018] 图5显示生物膜层干涉技术分析以测试莫他珠单抗和D25与从头或热处理的 RSV-F蛋白的结合，接着是与兔抗-6-螺旋束多克隆抗体（图5B)或抗-RSV-F C位点单克 隆抗体1331H(图5B插入图）的随后结合。莫他珠单抗和D25被固定至抗人IgG Fc捕获 传感器（图5A)。
[0019] 图6显示RSV-F蛋白上已知的抗原部位。RSV-F具有至少六个不同的通常描述的 中和抗原位点，包括位点A/II、B/I、和C。
[0020] 图7显示竞争结合测定，使用具有已知的抗原位点的不同的抗-RSV-F抗体，以鉴 定D25表位。对于所有这些结合测定使用100ng/ml生物素标记D25抗体。图7A-D显示通 过已知的抗RSV-F抗体分别与A/II、B/I、C或未知位点的结合的竞争。
[0021] 图8显示，氨基酸209对于抗体AM23的中和活性是重要的。
[0022] 图9显示在提出的D25抗原性位点中RSV-F野生型序列和D25单克隆抗体抗性突 变体（MARM)的比对。加框的氨基酸指示这些突变。
[0023] 图10显示RSV-F蛋白上的D25表位的作图。图10A是显示在鉴定的D25单克隆 抗体抗性突变体（MARM)中的3个氨基酸突变的定位的图解。图10B是显示RSV-F蛋白表 面上的鉴定的D25表位的定位的空间填充模型。粗体白色箭头指示鉴定的D25结合的临界 表位区域。
[0024] 图11显示比较了 D25和莫他珠单抗（"莫他"）单克隆抗体对D25MARM的活性的 中和测定。
[0025] 图12显示通过帕利珠单抗和D25单克隆抗体进行的对感染有D25MARM的细胞的 基于细胞的中和测定。
[0026] 图13是说明了 SK-表位的构建的图解。加下划线的序列对应于RSV A2 F蛋白的 氨基酸195-211，并且加双下划线的序列对应于RSV A2 F蛋白的氨基酸212-228,该RSV A2 F蛋白具有C212S取代。
[0027] 图14显示通过生物膜层干涉技术分析的D25与RSV A2 F蛋白的HR1区域或SK-表 位的结合的比较。 详细说明 定义
[0028] 贯穿本披露，术语"一个（a/an) "或"一种（a/an) "实体是指一个或多个或一种或 多种该实体；例如，"一种多核苷酸"应被理解为表示一种或多种多核苷酸。因此，术语"一 个"（或"一种"）、"一个或多个（一种或多种）"、以及"至少一个""至少一种"）在此可 互换地使用。
[0029] 此外，在本文中使用"和/或"应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定 的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在此在措词如"A和/或B"中所使用的术 语"和/或"旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"（单独）、以及"B"（单独）。同样，如在措词 如"A、B和/或C"中所使用的术语"和/或"旨在涵盖以下方面中的每一者：A、B、和C ;A、 B、或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A (单独）；B (单独）；以及C (单独）。
[0030] 应当理解，当用语言"包含"来说明方面时，还提供了关于"由……组成"和/或"主 要由……组成"描述的其他类似方面。
[0031] 除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属 的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，生物医学与分子生物学简明词典（Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo, Pei-Show，第二版，2002, CRC 出版社；细胞与分子生物学词典（The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第 三版，1999,学术出版社（Academic Press);以及生物化学与分子生物学牛津词典（Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000,牛津大学出版社 (Oxford University Press)为技术人员提供了在本披露中使用的许多术语的通用词典。
[0032] 单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统（SI)接受形式表示。数值范围包括定 义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在 此提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获 得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
[0033] 如在此使用的，术语"多肽"旨在涵盖单数"多肽"以及复数"多肽"，并且包含两个 或更多个氨基酸的任何链或多个链。因此，如在此使用的，"肽"、"肽片段"、"蛋白"、"氨基酸 链"、"氨基酸序列"、或用来指代两个或更多个氨基酸的链或多个链的任何其他术语，都一 般被包括在定义"多肽"中，尽管这些术语的每一者都可具有更具体的含义。术语"多肽"可 以用来替代任何这些术语或者与其可互换地使用。该术语进一步包括已经历翻译后或合成 后修饰的多肽，这些修饰例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团 进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。
[0034] 更确切地说，如在