用于将基因递送到细胞的功能化dna树状聚合物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于将基因递送到细胞并在所述细胞中表达所述基因的功能化DNA 树状聚合物的领域。
[0002] 背景
[0003] 由于治疗性DNA的递送允许直接治疗受影响的细胞，故基因疗法是针对多种细胞 异常、疾病和病症的一种颇具前景的治疗。理论上，将DNA靶向递送到期望的细胞，以及一 旦DNA被细胞吸收即控制表达的能力应当提供使用常规疗法难以实现的改善水平的治疗 效率和特异性。但实际上，DNA疗法的潜力尚未得到完全实现。一种挑战是用于将DNA递 送到细胞的适当载体的选择。病毒载体会引起严重的副作用。因此，已经寻求非病毒载体。 已经研究使用阳离子脂质体将基因转移到细胞中，但尚未得到令人满意的结果。
[0004] 近来，通过使编码DNA与阳离子聚合物络合所形成的纳米粒子对于基因疗法已经 显示前景，特别是当加入官能团来改善递送和治疗功效时（例如，用以改善细胞特异性和 积聚的靶向部分，以及用以改善细胞吸收的膜渗透部分，及用于防止降解的特征）。这些官 能团中有许多被认为是将治疗性生物试剂（包括基因）递送到细胞所必须的。不幸的是， 其还增加基因治疗剂的复杂性和其生产成本。此外，DNA凝聚之后的分子量、大小、电荷以 及端基封端的选择会对纳米粒子的转染潜力具有巨大并且无法预计的影响。另外，阳离子 聚合物纳米粒子在与将另外改善其特异性的靶向部分偶联之后，通常会损失其DNA递送能 力。然而，使用阳离子聚合物纳米粒子将DNA递送到细胞的一个优势在于其能够递送较大 的DNA有效负载。
[0005] DNA树状聚合物是由互连的天然或合成核酸单体亚单位构建的复杂分支状分子。 每个单体是由两条DNA链构成，这两条DNA链共用位于每条链的中心部分中的序列互补区。 这两条链退火形成单体，从而产生了中心双链"腰（waist)"邻接四个单链"臂"的结构。在 不同单体类型末端处的单链"臂"被设计成与互补单体类型的"臂"碱基配对。这允许从单 一起始单体开始，将树状聚合物定向组装成一系列逐步单体层。树状聚合物的一个有用特 征是，最后一层单体的添加在分子的表面上留下未配对的单链"臂"。表面层单链"臂"的数 量随层数而增加。在表面上的单链"臂"可用于附接多个分子以为树状聚合物提供官能团， 包括对特定应用特异的标记或分子。功能分子可以直接偶联到树状聚合物臂，或经由与树 状聚合物臂杂交进行附接。由于可用的单链"臂"具有多样性，故可以将多种不同的官能团 附接到树状聚合物，例如靶向部分和标记。已经认识到，树状聚合物可以在多种测定中提供 增强的检测特异性和灵敏度。
[0006] 特定细胞中白喉毒素（DT)基因的靶向表达会导致这些细胞死亡。白喉毒素是选 择用于细胞消融的毒素之一，因为其作用机制是众所周知的，并且这种基因已经被克隆，测 序并适用于在哺乳动物细胞中表达。由白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheria)分 泌的前体多肽随后经酶促裂解成A链和B链片段。B链与真核细胞的表面结合并且将A链 递送到细胞质中。DT-A抑制细胞内的蛋白质合成并且具有极高毒性；单一分子就足以杀死 细胞。已经在用于驱动表达的细胞特异性、顺式作用转录调控元件的控制下，独立于DT-B 亚单位克隆出DT-A亚单位的编码序列。在DT-A亚单位杀死细胞之后，其可以从死亡的细 胞释放；然而，DT-A不能进入相邻细胞。
[0007] 因此，需要将可表达的基因靶向递送到细胞的组合物和方法，这些组合物和方法 是可预测的，具有特异性并且在内化这些基因的众多细胞中提供显著功效。本发明解决这 些要求。 发明概要
[0008] 在第一方面，本发明涉及包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的组 合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列，所述DNA序列与调控所述编码多 肽或调控RNA的DNA序列的表达以产生编码所述多肽的RNA或产生所述调控RNA的DNA序 列连接。此类DNA树状聚合物在本文中称为"功能化" DNA树状聚合物。
[0009] 在连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的具体实施方案中，调控表达的 DNA序列包括启动子。
[0010] 在前述的另一个具体实施方案中，启动子基本上仅在特定细胞类型，例如上皮细 胞、病毒感染的细胞、患病或受损细胞或者肿瘤细胞中具有转录活性。基本上仅在特定肿瘤 细胞中具有转录活性的启动子可以是例如与胰腺癌相关的启动子（例如，间皮素（MSLN)启 动子）或与前列腺癌相关的启动子（例如细胞角蛋白5 (K5)启动子）。基本上仅在病毒感 染的细胞中具有转录活性的启动子可以是例如HPV16基因组的主要早期启动子p97的调控 序列。或者，基本上在特定细胞类型中具有转录活性的启动子可以是基本上仅在子宫颈鳞 状柱状（SC)接合部细胞中具有转录活性的启动子，如ARG2基因启动子。这一方法在本文 中可以称为"靶向基因表达"。胰腺癌相关性启动子可以是MSLN启动子。前列腺癌相关性 启动子可以是K5。
[0011] 在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码细胞毒素。在 具体实施例中，细胞毒素是白喉毒素A。
[0012] 在前述任何实施方案中，编码多肽的DNA序列可以编码免疫调节蛋白。在具体实 施例中，免疫调节蛋白是细胞因子或趋化因子。细胞因子和趋化因子的其它非限制性实例 包括 IL-2、IL-6 及 RANTES。
[0013] 在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码荧光蛋白。在 具体实施例中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白（GFP)或青荧光蛋白（CFP)。
[0014] 在前述任何实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列可以编码调控RNA。在具 体实施例中，调控RNA是shRNA、miRNA或miRNA前体，或siRNA。在另一个具体实施例中， 调控RNA是针对吲哚胺2, 3-双加氧酶（ID0)的shRNA。
[0015] 在前述任何实施方案中，与DNA树状聚合物连接的一个或多个DNA序列可以包含 编码多种多肽或多种调控RNA的DNA序列。在具体实施方案中，这些DNA序列编码多种多 肽、多种调控RNA或多肽与调控RNA的组合。
[0016] 在前述任何实施方案中，DNA树状聚合物可以另外包含与其连接的细胞内化部分。 在具体实施方案中，细胞内化部分是与细胞表面蛋白质结合的抗体、与细胞表面蛋白质结 合的肽或与细胞表面受体结合的配体。在一个特定实施方案中，细胞内化部分是与转铁蛋 白受体结合的抗体或肽。
[0017] 在另一方面，本发明提供了包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物以 及药学上可接受的载体的药物组合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列， 所述DNA序列与调控所述编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达的DNA序列连接。所述药 物组合物中的DNA树状聚合物可以是根据以上论述的任何实施方案的功能化DNA树状聚合 物。在具体实施方案中，编码多肽或调控RNA的DNA序列编码对细胞或组织有毒性的多肽 或调控RNA。毒性多肽可以是例如细胞毒素，如白喉毒素A。
[0018] 在所述药物组合物的具体实施方案中，用于功能化DNA树状聚合物的药学上可接 受的载体是通过促进细胞直接暴露于功能化DNA树状聚合物来将组合物靶向局部递送到 细胞的一种物质。举例来说，可以使用局部递送媒介物作为功能化DNA树状聚合物的载体 并且直接施用到期望的位置以促进DNA树状聚合物被细胞吸收。在一个具体实施方案中， 局部递送媒介物可以是一种复合材料，包括粘膜粘附复合材料（例如，葡聚糖醛聚合物粘 膜粘附材料）。在另一个具体实施方案中，药物组合物可以局部施用到子宫颈鳞状柱状接合 部细胞以治疗HPV-16感染的细胞。
[0019] 在又一方面，根据前述任何实施方案的功能化DNA树状聚合物可以用于治疗细 胞，如病毒感染的细胞、癌细胞或癌变前细胞的疾病和病症的方法中。在所述方法的具体实 施方案中，将功能化DNA树状聚合物以有效治疗疾病或病症的量向有需要的患者施用。在 具体实施方案中，DNA树状聚合物通过细胞内化部分而被靶向细胞。或者，或另外，DNA树状 聚合物通过如以上所描述的药物组合物的载体而被靶向细胞。编码多肽或调控RNA的DNA 序列一般将针对期望细胞的毒性进行选择。选择所连接的调控编码多肽或调控RNA的DNA 序列的表达的DNA序列一般基本上仅在所期望的细胞中具有转录活性；然而，如果认为调 控序列对期望的细胞类型不具有足够的转录特异性，那么可以使用药学上可接受的载体的 选择来改善功能化DNA树状聚合物向期望的细胞递送的特异性。或者，可以使用适于局部 递送组合物的药学上可接受的载体使包含与编码多肽或调控RNA的DNA序列连接的非转录 特异性序列的DNA树状聚合物靶向期望的细胞。因此，这一方面还涉及功能化树状聚合物 用于治疗细胞，如病毒感染的细胞、癌细胞或癌变前细胞的疾病和病症的用途，其中调控基 因转录的DNA序列在这些细胞中具有转录活性并且编码多肽或调控RNA的DNA序列对这些 细胞具有毒性。
[0020] 在另一方面，根据前述任何实施方案的功能化DNA树状聚合物可以用于鉴别HPV 感染的上皮细胞和/或使其可视的方法中，所述方法包括将权利要求16所述的药物组合物 局部施用到HPV感染的上皮细胞，其中调控基因转录的DNA序列在HPV感染的上皮细胞中 具有特异性转录活性，并且所编码的多肽在HPV感染的HPV细胞中可以检测到。因此，这一 方面还涉及功能化树状聚合物用于在体内、离体或体外鉴别HPV感染的上皮细胞和/或使 其可视的用途，其中调控基因转录的DNA序列在HPV感染的上皮细胞中具有特异性转录活 性，并且所编码的多肽在HPV感染的细胞中可以检测到。
[0021] 附图简述
[0022] 本专利或申请文件含有至少一个以彩色绘制的附图。这一带有彩色附图的专利或 专利申请公布的复本将在提出请求并缴纳必要费用之后由专利局提供。
[0023] 图1A是功能化DNA树状聚合物的结构的彩色图示。图1B是显示实施例1中所描 述的体外实验的结果的彩色照片。图1C是显示实施例1中所描述的体内实验的结果的彩 色照片。
[0024] 图2是显示实施例2中所描述的体内实验的结果的一系列彩色照片。
[0025] 发明详述
[0026] 在描述本发明的若干示例性实施方案之前，应了解，本发明不限于以下说明中所 陈述的构造或方法步骤的细节。本发明能够包含其它实施方案，并且能够以各种方式实施 或进行。
[0027] 在本说明书通篇所提到的"一个实施方案"、"某些实施方案"、"一个或多个实施方 案"或"一实施方案"意思指在本发明的至少一个实施方案中包括了结合该实施方案描述的 特定特征、结构、材料或特性。因此，在本说明书通篇各处出现的短语，如"在一个或多个实 施方案中"、"在某些实施方案中"、